Методики РЦ КМ
Культуры поддерживаются в стеклянных пробирках объемом 14 или 16 мл при температуре 10˚С. Среда для культивирования: 0,04 % отвар салатных листьев на дистиллированной воде, инкубированный с пищевыми бактериями. Кормление культур инкубированной салатной средой производят раз в две недели с частичной или полной заменой среды.
Культуры поддерживаются в культуральных флаконах объемом 50мл или чашках Петри диаметром 60 или 90 мм, при температуре 18˚С.
Культуры поддерживаются в стеклянных чашках Петри диаметром 90 мм или бактпечатках, при температуре 18˚С. Среда для культивирования Прескотт-Карриер, пищевые объекты – инфузории Tetrahymena pyriformis. Кормление культур и смена среды через день, пересадка со сменой среды раз в неделю. Возможно поддержание культур на среде Прескотта-Карриера с рисовыми зернами и инокулированной в среду смесью инфузорий Colpidium sp. и жгутиконосцев Chilomonas sp.
Штаммы коллекции поддерживаются в виде растущих или покоящихся культур на жидких или агаризованных синтетических питательных средах.
Основные питательные среды 1, 3, 6, 12, 16 и 17 разработаны в лаборатории микробиологии (Громов Б.В., Титова Н.Н, 1983).
1. Образец природной воды с находящимися в ней микроорганизмами тщательно обследуют под бинокуляром. В микроаквариум ("солонку") вносят 0.5-1 мл исследуемой воды без инфузорий. С помощью капиллярной пипетки отбирают клетки парамеций и помещают в микроаквариум.
2. Клетки парамеций необходимо отмыть от сопутствующих микроорганизмов. Для этого с помощью капиллярной пипетки клетки из исходного микроаквариума переносят по одной в микроаквариум с бактериальной средой, используемой для кормления парамеций (0.5-1 мл). Процедуру повторяют еще 2-4 раза.
1. Образец донного грунта и/или воды из водного экотопа отбирают в стерильную посуду и как можно скорее транспортируют в лабораторию.
2. Для выделения микроорганизмов подготавливают необходимое количество флаконов для культивирования объемом 50 мл и/или чашек Петри диаметром 90 мм. Следует учитывать, что в силу высокого уровня пространственной микрогетерогенностидонных местообитаний увеличение объема высеваемого грунта позволит охватить больше имеющихся в данном экотопемикрониш, вследствие чего увеличить фракцию видов, обнаруживаемых этим методом (в случае, если задача исследования подразумевает наиболее полный охват состава данного сообщества).
Для проведения экспериментов используется культура бактерий в стационарной фазе роста.
Перед началом эксперимента определяется исходная плотность культуры с использованием спектрофотометра.
Экспериментальное воздействие осуществляется в соответствии с конкретными характеристиками тестируемого вещества.
Оценка результатов воздействия производится путем высева тестируемой культуры на чашки Петри с агаризованной средой LB. Чашки инкубируют в течение суток при температуре 37°С и затем подсчитывают количество сформировавшихся колоний (в опыте и контроле).
1. Клетки парамеций, содержащие инфекционные частицы бактерий, концентрируют до объема 1-1.5 мл в пробирке "эппендорф".
2. К полученному объему клеток добавляют детергент NonidetNP40 концентрации 1% из расчета: 1 мл клеток – 100 мкл 1% детергента; интенсивно взбалтывают.
3. Содержимое лопнувших клеток вместе с инфекционными частицами бактерий осаждают центрифугированием (6000 об/мин х 5 мин).
Для изучения микроорганизмов используются, преимущественно, прижизненные методики, которые предполагают использование прямых и инвертированных световых микроскопов, снабженных различными системами для усиления оптического контраста. В общем случае, при изучении объектов при помощи светового микроскопа, пучок света от осветителя, фокусируемый при помощи конденсора, проходит через объект, после чего изображение формируется объективом и дополнительно увеличивается окуляром, черезкоторый изображение проецируется на сетчатку глаза или матрицу цифровой камеры. При изучении клеток непосредственно в культуре используют инвертированные микроскопы, в которых источник света располагается над объектом, а объектив – под ним, что позволяет рассматривать содержимоекультуральных сосудов сквозь их дно. Это позволяет изучать минимально потревоженные клетки в естественной для них среде. Однако разрешение при таких исследованиях остается не очень высоким, поскольку максимальное увеличение используемых объективов составляет 40-63.
В ресурсном центре возможна реализация всех этапов подготовки материала для рутинных молекулярных исследований. Основной набор задач, который может быть решен на базе центра, сводится к определению нуклеотидной последовательности определенного участка генома изучаемого штамма. Это необходимо для: (1) проверки степени очистки культивируемого штамма; (2) идентификации культивируемого штамма с использованием молекулярных методов (в том числе, ДНК-штрихкодирования); (3) определения положения культивируемого штамма на молекулярном филогенетическом древе.
Эти задачи решаются при помощи амплификации определенного участка генома изучаемого организма методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей очисткой и, при необходимости, клонированием полученного продукта реакции (ампликона). Очищенный (клонированный) фрагмент ДНК передается пользователю и может быть использован для последующих процедур, в частности, чтения нуклеотидной последовательности методом Сэнгера.
