1. Образец донного грунта и/или воды из водного экотопа отбирают в стерильную посуду и как можно скорее транспортируют в лабораторию.

2. Для выделения микроорганизмов подготавливают необходимое количество флаконов для культивирования объемом 50 мл и/или чашек Петри диаметром 90 мм. Следует учитывать, что в силу высокого уровня пространственной микрогетерогенностидонных местообитаний увеличение объема высеваемого грунта позволит охватить больше имеющихся в данном экотопемикрониш, вследствие чего увеличить фракцию видов, обнаруживаемых этим методом (в случае, если задача исследования подразумевает наиболее полный охват состава данного сообщества).

3. Сосуды для изоляции заполняют на 1/3-1/2 объема стерилизованной при помощи фильтрации через фильтр с диаметром пор 0.2 мкм водой из изучаемого местообитания, минеральной средой Прескотта-Джеймса или искусственной морской водой. В качестве источника органики в среду, как правило, добавляют зерна риса, пшеницы или отвар церофила (0.025%).

4. В подготовленные сосуды стерильными инструментами вносят порции грунта из отобранных проб в объемном соотношении 1:200-1:100 (0.1-0.2 мл грунта на 20 мл жидкой среды). Грунт следует вносить таким образом, чтобы он концентрировался на ограниченном участке дна культурального сосуда, оставляя существенную часть поверхности дна свободной.

5. Высевы инкубируют при стабильной температуре и разных режимах освещенности, в зависимости от задач исследования.

6. В течение 1-8 недель после высева высеянные пробы просматривают при помощи бинокулярных и инвертированных микроскопов.

7. Обнаруженные клетки выделяют в культуру, для чего их отлавливают оттянутой стеклянной пипеткой и переносят в новые культуральные сосуды со свежей средой, в последующем следя за их ростом.

8. При необходимости амеб клонируют, для чего, промыв культуру в нескольких сменах стерильной среды, клетки отлавливают оттянутой пипеткой по одной и переносят в чашки Петри диаметром 40 или 60 мм со стерильной средой. За ростом клонов и степенью их очистки следят в течение 2-3 недель. Обычно клонирование повторяют дважды. В случае, если доля успешных клонов составляет более 30%, клонирование рекомендуется повторить, поскольку в этом случае велика вероятность, что часть полученных культур содержат потомков нескольких клеток.

9. Выросшие клоны пересевают в чашки Петри диаметром 60 или 90 мм и/или флаконы для культивирования объемом 50 мл.

Литература:

• 1. Page F.C. 1988. A new key to Freshwater and Soil Gymnamoebae. Ambleside, Freshwater Biol. Ass. 122 p.
• 2. Smirnov A.V., Brown S. Guide to the methods of study and identification of soil gymnamoebae. Protistology. 2004. 3 (3), 148-190.