1. Клетки парамеций, содержащие инфекционные частицы бактерий, концентрируют до объема 1-1.5 мл в пробирке "эппендорф".
2. К полученному объему клеток добавляют детергент NonidetNP40 концентрации 1% из расчета: 1 мл клеток – 100 мкл 1% детергента; интенсивно взбалтывают.
3. Содержимое лопнувших клеток вместе с инфекционными частицами бактерий осаждают центрифугированием (6000 об/мин х 5 мин).
4. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость и промывают осадок от детергента. Для этого к осадку добавляют 1-1.5 мл дистиллированной воды, ресуспендируют осадок и повторяют ценионной картины по обе стороны стекла.
5. С помощью пипеточного дозатора вносят в камеру объем гомогената, достаточный для покрытия штрихованной сетки.
6. Производят подсчет инфекционных частиц в «большом квадрате» (рекомендуется обсчитать 5-10 квадратов и использовать среднее значение). Объем "большого квадрата" равен 4х10-6 мл.
Расчет количества инфекционных частиц бактерий в данном объеме гомогената рассчитывается по формуле:
N = V1 ͯ n / V2,
где N – количество инфекционных частиц бактерий в данном объеме гомогената;
V1 – объем гомогената, мл;
V2 – объем "большого квадрата", 4ͯ10-6 мл;
n – количество инфекционных частиц в "большом квадрате".
7. Для проведения инфекции гомогенат инфекционных частиц бактерий добавляют к парамециям-реципиентам исходя из соотношения 100:1. Так, к 1 мл культуры парамеций, содержащей ~1000 (103) клеток, вносят 105 бактерий (рекомендуется добавить 100-200 мкл пищевых бактерий для более эффективного заглатывания инфекционных бактерий). Суспензию клеток с добавленными бактериями перемешивают и оставляют на сутки.
8. На следующий день зараженные культуры немного подкармливают и далее ведут в обычном режиме.
9. Процесс инфекции можно контролировать с помощью микроскопа. Появление новых инфекционных частиц Holospora происходит в течение 7-14 дней.
Данная методика подходит для инфекции P.caudatum – бактериями H.obtusa, H.undulata, H.elegans; P.bursaria – бактериями H.acuminata и H.curviuscula; P.aurelia – бактериями H.caryophila. Возможно также (предположительно) заражение по данной методике парамеций бактериями, относящимися к группе Holospora-like.
Литература:
Preer L.B. Alpha, an infection macronuclear symbiont of Paramecium Aurelia. J. Protozool. 1969. V. 16. p. 570-578.
