Методики пробоподготовки
В общем случае, приготовление тотальных препаратов включает три основных этапа: фиксация объекта, окраска и обезвоживание в спиртах с последующим заключением в бальзам или другую заливочную среду.
Из фиксаторов наиболее распространенный – жидкость Буэна:
Фиксирующая смесь:
1 вариант. 4% глутаральдегид и 1% OsO4 на 0.1 М какодилатном (или фосфатном) буфере (рН 7.4 или 7.2). Фиксацию проводят на тающем льду в темноте в течение 1 ч., с полной заменой фиксатора через 30 мин. после начала фиксации;
2 вариант. 4% глутаральдегид на 0.1 М какодилатном (или фосфатном) буфере (рН 7.4 или 7.2);
3 вариант. клетки префиксируют в парах OsO4 в течение 10-15 мин., затем фиксируют 4% глутаральдегидом.
В ресурсном центре возможна реализация всех этапов подготовки материала для рутинных молекулярных исследований. Основной набор задач, который может быть решен на базе центра, сводится к определению нуклеотидной последовательности определенного участка генома изучаемого штамма. Это необходимо для: (1) проверки степени очистки культивируемого штамма; (2) идентификации культивируемого штамма с использованием молекулярных методов (в том числе, ДНК-штрихкодирования); (3) определения положения культивируемого штамма на молекулярном филогенетическом древе.
Эти задачи решаются при помощи амплификации определенного участка генома изучаемого организма методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей очисткой и, при необходимости, клонированием полученного продукта реакции (ампликона). Очищенный (клонированный) фрагмент ДНК передается пользователю и может быть использован для последующих процедур, в частности, чтения нуклеотидной последовательности методом Сэнгера.
