Комплекс методов проточной цитометрии позволяет измерять физические и химические параметры отдельных клеток или частиц. Он основан на регистрации флуоресценции и светорассеяния от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в струе жидкости. Методы проточной цитометрии чаще всего применяется при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. Также можно исследовать диссоциированные клетки любых тканей, дрожжевые клетки, бактериальные клетки, микропланктон, флуоресцентные микросферы с зондами.
Оптическая микроскопия как никакой другой метод смогла продемонстрировать для биологии взаимосвязь доступных методов исследования и получаемых научных результатов. Возможность исследовать биологический объект прижизненно, непосредственно наблюдать происходящие процессы оставляет этот метод методом выбора во многих исследованиях. В ресурсном центре представлена современная микроскопическая техника включая конфокальную и двухфотонную микроскопию, методы сверхразрешения, специальные оптические методы такие, как детекция отдельных флуоресцентных молекул, определение концентрации исследуемых веществ в живых клетках, определение скорости диффузии биогенных молекул и т.д. Важной составляющей является наличие всего необходимого оборудования для работы с живыми клетками включая микроманипуляцию, массовое исследование и сортировку клеток на проточном сортирующем цитофлуориметре. Помимо оптического оборудования оборудования, в центре установлено современное программное обеспечение для морфометрии и обработки полученных изображений.
Геномика – это направление биологии исследующее структуру и функцию нуклеотидных последовательностей геномов живых организмов широком смысле: структурная геномика – последовательность нуклеотидов, наличия их модификаций, взаимодействий с белками; функциональная геномика – реализация генетической информации; систематическая геномика – использование последовательностей специфических участков ДНК для уточнения систематического положения живых организмов. Ресурсный центр предоставляет возможность секвенирования на нескольких различных платформах. Сэнджеровское (капиллярное) секвенирование – классический метод, позволяющий одновременно проводить небольшое количество сиквенсов. Массивное параллельное секвенирование следующего поколения (NGS) доступно на двух платформах Roche 454 GS Junior и ABI Ion Torrent. В центре имеется оборудование для приготовления библиотек под NGS, в связи с этим, центр консультирует пользователей по возможностям оборудования и разработке подходящего экспериментального дизайна.
Метаболомика изучает конечные и промежуточные продукты обмена веществ в клетке. Метаболомный анализ в настоящее время рассматриваться как одно из самых перспективных направлений развития молекулярных методов в области системной биологии.
Современная метаболомика далеко вышла за рамки рамки постгеномного анализа и оценки раннего фенотипического отклика. Биохимическое состояние системы, описываемое метаболитным профилем, вполне может выступать в роли альтернативного взгляда на биологический объект. Оценка устойчивости и динамики таких состояний может сопровождать практически любой биологический эксперимент, мониторинг или наблюдение. При этом полученные данные могут существенно помочь в понимании процессов, происходящих на молекулярном уровне и даже дать ключ к возможности реализации управления этими процессами. Залогом успеха применения подобного подхода является возможность одновременной качественной и количественной характеристики очень большого числа малых биомолекул в исследуемом образце (по некоторым оценкам среднее число компонентов метаболитной сети составляет более 5000 соединений). Метаболитный профайлинг может дать очень интересную информацию о состоянии и поведении сложных динамических систем, которыми, по сути, и являются биологические объекты. Для его успешной реализации необходима аналитическая техника высокого класса включая хроматоргафическое и масс-спектрометрическое оборудование, представленное в ресурсном центре.
Принцип работы
Электрофорез – это разделение заряженных макромолекул в пространстве при движении их под действием электрического поля. Ключевой характеристикой определяющей возможность разделения является подвижность макромолекулы. В общем случае подвижность зависит от физического размера молекулы, ее заряда и характеристики внешней неподвижной среды, в которой молекула движется. Условно эту характеристику можно назвать "обобщенная вязкость среды". На сегодняшний день при анализе биологических молекул электрофорезом используется поддерживающая пористая среда в виде гидрофильных гелей различного происхождения и пористости. Наиболее популярные используемые гели – полиакриламидные (ПААГ) и агарозные.
Стандартным электрофоретическим методом, наиболее часто используемым в протеомике и для анализа белков, является SDS – электрофорез по Лэмли (Laemli U, 1970) в ПААГ. Этот метод использует ступенчатую буферную систему (состав буфера меняется в пространстве разделения), которая позволяет уменьшить диффузию и тем самым повысить разрешение метода. Благодаря использованию в методе SD(L)S (sodium dodecyl(lauryl)sulfate, ДДС-додецил сульфат натрия, ЛСН – лаурил сульфат натрия) разделение белков происходит только по их размеру. SDS – является анионным ПАВ (поверхностно активное вещество), его молекулы в воде несут отрицательный заряд в широком диапазоне рН. При нагревании белков в растворе с SDS происходит практически полная их денатурация и они в присутствии SDS сорбируют на себе его молекулы так, что на единицу длины полипептидной цепи приходится практически постоянное число молекул SDS. Тем самым белки приобретают отрицательный избыточный постоянный удельный заряд (приходящийся на единицу длины (массы) белка). Собственный заряд белка при такой обработке становится практически незаметным с точки зрения его влияния на подвижность молекулы белка. Как видно из описания действия SDS, белки в методе Лэмли денатурированы и теряют свою нативную конформацию.
Реактивы
- - Нитрат серебра хч и выше.
- - Насыщенный раствор аммиака хч и выше.
- - Лимонная кислота хч и выше.
- - Натрия гидрооксид чда и выше.
- - Метанол от чда и выше или этанол-ректификат.
- - Раствор формальдегида 37-40% (формалин).
