ПААГ готовят непосредственно перед проведением эксперимента. Из раствора(ов) акриламида и бисакриалмида. В качестве инициатора полимеризации используют персульфат аммония(ПСА), а катализатора тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). Смесь для образования геля (состоящую из раствора акриламида, бисакриламида, буфера, SDS, инициатора и катализатора заливают в специально подготовленный блок (чаще всего это пластина). После изготовления (застывания, полимеризации, образования) блока геля его можно использовать для разделения в специально приспособленной для этого камере. Стандартно разделение происходит в вертикальном блоке.
Методики
Протокол SDS электрофореза по Лэмли.
Необходимые реактивы:
- 1. ТРИС (трис(гидроксиметил)аминометан, 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол,CAS N 77-86-1) основание. Для электрофореза по Лэмли требования к Трис достаточно высоки. Использования реактива низких квалификаций типа Ч. или reagent, без дополнительной очистки недопустимо. ВНИМАНИЕ!!! Использовать солянокислую соль ТРИС – НЕЛЬЗЯ!!!
- 2. Акриламид. Идеальной является квалификация electrophoresis grade, но часто подходят и более дешевые марки акриламида, определить пригодность можно только экспериментальным путем. Не рекомендуется использование реактива квалификации reagent, for synthesis и т.п.
- 3. Бис акриламид, требования к реактиву аналогичны требованиям к акриламиду.
- 4. SDS , также весьма желательно использование реактива квалификации for molecularbiology и выше.
- 5. Глицин (аминоуксусная кислота), можно использовать реактив квалификации electrophoresis grade и выше, не рекомендуется использовать реактив квалификации ч. и reagent.
- 6. Соляная кислота квалификации ХЧ и выше (можно использовать разбавленный до 6 М реактив).
- 7. Персульфат аммония допустимо использование реактива ч и чда после тестирования. Так же необходимо тестировать реактив, если он хранился после даты выпуска более года.
- 8. Тетраметилэтилендиамин (TEMED) к нему не предъявляется очень высоких требований, но так как его расход очень небольшой, лучше использовать реактив высокого качества.
- 9. Глицерин можно использовать тоже без очень высоких требований – косметический , ч , чда, вполне подходят.
- 10. 2-Меркаптоэтанол (МЭ) или дитиотриэтол (ДТТ). К меркаптоэтанолу требования невысокие, но некоторые партии МЭ независимо от квалификации могут содержать примесь белков установить это можно только экспериментально. К ДТТ тоже требования невысокие.
- 11. Бромфеноловый синий – без высоких требований.
- 12. Дистиллированная вода – аналитической или фармацевтической чистоты.
- 13. Фильтровальная бумага.
Оборудование:
- 1. Камера для вертикального электрофореза с комплектом для заливки геля (стекла прокладки, устройство для заливки).
- 2. Блок питания постоянного напряжения с максимальным напряжением 300-400 V и мощностью от 50 W. Желательно, чтобы в блоке была стабилизация по току.
- 3. Автоматические пипетки со сменными наконечниками на варьируемые объемы: 1-10 мкл (2-20 мкл), 20-200 мкл, 100-1000 мкл. Наконечники к ним.
- 4. Полипропиленовые микропробирки – 1.5 мл (типа eppendorf).
- 5. Цилиндры мерные на 10, 50, 100, 250, 1000 мл. Вместо 10 мл и 50 мл цилиндров можно использовать центрифужные полипропиленовые пробирки на 15 мл и 50 мл (типа falcon) с нанесенными делениями.
- 6. Весы лабораторные с минимальным пределом взвешивания 0.5 г и максимальным 500 г, с ценой деления 10 мг.
- 7. рН метр с ценой шкалы 0.01 рН.
- 8. Пипетки стеклянные, градуированные на слив – 5 и 10 мл.
- 9. Общелабораторная посуда: стаканы термостойкие, воронки, стеклянные палочки, банки для растворов с пробками и т.д.
- 10. Водяная баня со штативом под микропробирки 1.5 мл или твердотельный термостат с гнездами под те же пробирки.
- 11. Магнитная мешалка (можно самого начального уровня) с набором магнитных якорей в полипропиленовой или политетерафторэтиленовой оболочке.
Приготовление запасных растворов
1) 10% SDS, 200 мл
Взвесить 20 г SDS, перенести количественно (ополаскивая небольшим 5-10 мл количеством воды посуду для взвешивания и собирая промывки в посуде для приготовления. Посуда для приготовления должна содержать надежную метку, указывающую объем 200 мл. Поместить в посуду для приготовления чистый якорь для магнитной мешалки и при постоянном перемешивании добавить сначала примерно 100 мл воды, а потом при постоянном перемешивании постепенном растворении довести объем раствора водой до метки 200 мл и дождаться полного растворения. Извлечь якорь и довести объем до метки 200 мл, размешать раствор стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Хранить при комнатной температуре, в холодильнике выпадает в осадок.
2) 30/1 акриламид (АА30/1), 100 мл
Взвесить 29 г акриламида, перенести количественно в посуду для растворения. Взвесить 1 г бисакриламида и перенести количественно в посуду для растворения. Посуда для растворения должна иметь надежную метку, соответствующую объему 100 мл.
Добавить 50 мл воды, нагретой до 50-600оС погрузить чистый якорь магнитной мешалки медленно при постоянном перемешивании и растворении добавлять воду до метки 100 мл дождаться полного растворения. Извлечь якорь довести объем до метки 100 мл водой и размешать стеклянной палочкой до гомогенного состояния. Перелить раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой хранить на температуре +8-100оС (нежелательно хранить при более низкой температуре, может выпасть осадок).
3) 1.5 М Трис-HCl pH=8.8 (Трис-8.8), 100мл
Взвесить 18.2 г Трис-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100 мл. Добавить примерно 60 мл воды погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания от 40 до 90 об/мин. Осторожно (чтобы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям добавления концентрированной или 6 М соляной кислоты до значения 8.8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как вы довели рН до величины 8.8, доведите водой объем раствора до отметки 100 мл при постоянном перемешивании извлеките якорь и снова добавьте воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенесите раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-100оС.
4) Раствор 0.625 М Трис-HCl рН-6.8 (Трис-6.8), 100 мл
Взвесить 7.57 г Трис-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100мл. Добавить примерно 45-50 мл воды погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание. Добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания от 40 до 90 об/мин. Осторожно (что бы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям добавления концентрированной или 6 М соляной кислоты до значения 6.8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как вы довели рН до величины 6.8, доведите водой объем раствора до отметки 100 мл при постоянном перемешивании извлеките якорь и снова добавьте воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенесите раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-100оС.
5) 10% раствор персульфата аммония(ПСА), 10 мл
Взвесить 1 г персульфата аммония в новой или чистой и сухой пробирке из полипропилена типа falcon. Добавить в пробирку воды до отметки 7мл, закрыть герметичной пробкой и интенсивно встряхивая, перемешать. Поставить пробирку вертикально и дать стечь раствору вниз 10 мин. Довести объем раствора водой до отметки 10 мл и снова перемешать. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор хранить в холодильнике при температуре 4-100оС.
6) 10х Электродный буфер, 1л
Взвесить 144 г глицина и 30 г Триса-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, имеющую надежную метку объема 1 л. Добавить 0.7 л дистиллированной воды, погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки поставить раствор в посуде на мешалку и перемешивать до растворения, затем при перемешивании довести объем раствора до 1 л водой. Извлечь якорь, проверить объем, при необходимости довести до 1 л и перемешать стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-100оС.
Буфер для проб
Однократный буфер 20 мл
- Возьмите мерный цилиндр на 25 мл или полипропиленовую пробирку на 50 мл с делениями (типа falcon).
- Добавьте:
- 2 мл Трис-6.8,
- 5 мл 10%SDS,
- 2 мл глицерина,
- 10 мг БФС (бром феноловый синий) можно примерно на глаз.
- Доведите объем раствора до 20 мл, перемешайте встряхиванием. Хранить при комнатной температуре.
3х Буфер для проб 10 мл
- Возьмите полипропиленовую пробирку на 15 мл с градуировкой, типа falcon
- Добавьте:
- 3 мл Трис-6.8.
- Взвесьте и перенесите количественно 750 мг SDS в пробирку.
- Добавьте 3 мл глицерина.
- Добавьте 15 мг БФС (можно приблизительно не глаз).
- Доведите раствор горячей водой (50-800оС) до объема 10 мл и перемешайте встряхиванием.
Проведение электрофореза по Лэмли
Приготовление разделяющего геля.
Внимание!!! Все растворы для приготовления перед смешением должны иметь комнатную температуру
Раствор для геля 10 мл: возьмите любой сосуд, вмещающий в себя 10-15 мл раствора.
Добавьте 2.5 мл Трис рН-8.8 и необходимое для нужной концентрации акриламида (см. Таблица) количество раствора акриламида АА30/1 и воды.
Таблица
| Концентрация геля, % | 6 | 7 | 8 | 10 | 12 | 15 | 20 |
| Объем АА30/1, мл | 2 | 2.33 | 2.67 | 3 | 4 | 5 | 6.67 |
| Объем воды, мл | 5.29 | 4.96 | 4.62 | 4.29 | 3.29 | 2.29 | 0.62 |
Перемешать (без пузырей) раствор.
Добавить 100 мкл 10% SDS, перемешать без пузырей.
Собрать блок для заливки геля.
Добавить в раствор для геля сначала 100 мкл 10% ПСА и затем 10 мкл ТЕМЕД аккуратно размешать без пузырей и залить в блок для геля (в зависимости от конструкции наслоить на поверхность раствора в блоке небольшое количество воды). Дождитесь полимеризации геля.
Приготовление концентрирующего геля 5 мл
В посуду 10-15 мл добавьте:
1 мл Трис рН-6.8
0.75 мл АА30/1 и 3.145 мл воды.
Аккуратно перемешайте раствор без пузырей.
Добавьте 50 мкл SDS, перемешайте без пузырей.
Возьмите блок с заполимеризовавшимся разделяющим гелем, удалите из него лишнюю воду путем стекания на фильтровальную бумагу. Подготовьте гребенку. Подготовьте блок к заливке концентрирующего геля. Добавьте к раствору для концентрирующего геля 50 мкл 10% ПСА и 5 мкл ТЕМЕД аккуратно (без пузырей) перемешайте и залейте в блок вставьте гребенку для образования карманов в геле в блок. Дождитесь полимеризации концентрирующего геля.
Подготовка проб.
В "сухую" безводную пробу или в осадок белков в микропробирке 1.5 мл добавляют однократный буфер для проб. Затем в вытяжном шкафу добавляют 2-10%об меркаптоэтанола. Пробу интенсивно встряхивают (или пипетируют автоматической пипеткой) и помещают в кипящую водяную баню или термостат на 100оС, время инкубации от 5 до 30 мин. После инкубации пробы центрифугируют при 10 000-12 000g от 30 с. до 15 мин. в зависимости от того, как они растворились. Вместо МЭ можно использовать 100-200 мМ конечную концентрацию DTT из стокового 1М раствора (хранить на -20 в герметичной таре залитой под пробку). Перед употреблением разморозить и взболтать, затем отобрать небольшой объем и нагреть до 50-60оС и внести в пробу необходимый объем.
Жидкая проба
В жидкую пробу (раствор белка) добавляют половину объема пробы трехкратного буфера для проб, далее добавляют 2-10%об от общего объема меркаптоэтанола. Далее поступают аналогично "сухой" пробе.
Проведение электрофореза
Поместите залитый блок в камеру приготовьте электродный буфер в объеме необходимом для камеры. Для этого 10х электродный буфер надо развести в отношении 1:9. Залейте электродный буфер в камеру. В верхнюю камеру (католит) ОБЯЗАТЕЛЬНО!!!! нужно добавить 10%SDS в объеме 0.01 объема буфера в верхней камере.
Нанесите пробы в карманы геля. Для нанесения используют микрошприц типа Hamilton на 10, 25, 50,100 мкл (в зависимости от загрузок) или автоматическую пипетку со специальным оттянутым наконечником для нанесения проб в гель. Подключите камеру к блоку питания. Обычно используется три режима в течение хода электрофореза:
- 1) вхождение проб в концентрирующий гель. Напряжение примерно 5 В/см;
- 2) пробы в концентрирующем геле. Напряжение примерно 7-10 В/см;
- 3) пробы вошли в разделяющий гель. Напряжение примерно 20-35 В/см.
В см. выражена длина геля.
Окончание электрофореза контролируют при подходе фронта красителя БФС к нижней границе геля.
Окраска и дальнейшие манипуляции с гелем зависят от целей эксперимента.
Требования к образцам.
- 1) Для успешного проведения эксперимента. Необходимо знать количественное содержание общего белка и белка интереса в образцах.
- 2) В образцах не должно содержаться большое количество сильной кислоты и щелочи, более 50 мМ концентрации.
- 3) В образцах должна отсутствовать соль в высокой концентрации, более 250 мМ в пересчете на ионную силу NaCl.
- 4) Плохо растворимые и мембранные белки требуют модифицированных, отличных от стандартной процедуры, методик.
