Помимо секвенирования, в центре доступно оборудование для количественного ПЦР (qPCR) и генотипирования. Центр консультирует по выбору подходящей платформы и расходных материалов, также как и по всем аспектам от разработки экспериментального дизайна до анализа данных. Цифровая ПЦР (DD-PCR) лучшим образом подходит для поиска одиночных полиморфизмов (SNP) и количественного ПЦР. Микрофлуидная система высокопроизводительного ПЦР (Fluidigm) является инструментом выбора для проектов, включающих большое количество измерений генной экспрессии.
Несмотря на бурное развитие направления исследований, отвечающего на вопросы "что?" и "как?" происходит в эксперименте, во многих случаях требуется отвечать на вопрос "где?" – уточнять локализацию описываемых изменений экспрессии генов. Особенно востребована такая задача в биологии развития и нейробиологии. Для реализации этого направления исследований доступна роботизированная платформа для проведения флуоресцентной in-situ гибридизации (FISH). Выделение микроучастков препарата для последующего анализа с максимальной чистотой возможно с использованием бесконтактного комплекса лазерной микродиссекции.
Важной вехой бурного развития геномики явилась доступность вычислительных ресурсов и появление специализированного программного обеспечения для задач биоинформатики. Для обработки получаемых в ходе количественного ПЦР, высокопроизводительного ПЦР, секвенирования, данных, Центр обеспечивает доступ к соответствующим вычислительным ресурсам и программному обеспечению.
Методы измерения концентрации нуклеиновых кислот
Секвенирование по Сэнджеру с помощью капиллярного электрофореза
Фрагментный анализ с помощью капиллярного электрофореза
Методы измерения концентрации нуклеиновых кислот
Используемое оборудование РЦ:
флуориметр QuantiFluor (Promega), флуориметр Qubit 2.0 (Invitrogen).
Принцип метода:
Для измерения концентрации используется флуоресцентный краситель, специфически связывающийся с определённым типом нуклеиновой кислоты: дцДНК, оцДНК или РНК, причём интенсивной флуоресценцией обладает только связанная форма красителя. Таким образом, в отличие от спектрофотометрического метода измерения концентрации нуклеиновых кислот данный метод не зависит от присутствия в растворе свободных нуклеотидов, солей, белков и различных растворителей.
Варианты метода:
По типу измеряемой нуклеиновой кислоты:
- Для дцДНК могут использоваться следующие наборы реактивов:
- Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589);
- Qubit® dsDNA Broad Range Assay Kit (Invitrogen Q32850);
- Qubit® dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Invitrogen Q32854).
- Для оцДНК – набор Qubit® ssDNA Assay Kit (Invitrogen Q10212).
- Для РНК – набор Qubit® RNA Assay Kit (Invitrogen Q10212).
По типу кюветы для измерения флуоресценции:
Для флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen) используются одноразовые полипропиленовые пробирки объёмом 500 мкл (Axygen PCR-05-C), объём измеряемого образца 200 мкл, а для флуориметра QuantiFluor (Promega) – многоразовая метакрилатная кювета сечением 10x10 мм, объём измеряемого образца – 2 мл.
Характеристики чувствительности различных вариантов метода:
|
Набор |
Диапазон измеряемой концентрации |
|
Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit |
2.5 нг/мл - 100 мкг/мл |
|
Qubit® dsDNA BR Assay Kit |
10 нг/мл - 10000 нг/мл |
|
Qubit® dsDNA HS Assay Kit |
0.5 нг/мл - 500 нг/мл |
|
Qubit® ssDNA Assay Kit |
1 нг/мл - 1000 нг/мл |
|
Qubit® RNA Assay Kit |
20 нг/мл - 1000 нг/мл |
Протокол метода
- Приготовить рабочий раствор флуоресцентного красителя.
- Провести калибровку прибора растворами с известной концентрацией нуклеиновых кислот в соответствии с руководствами к наборам для измерения и флуориметру.
- Провести измерение образцов. Если полученное значение концентрации выходит за пределы измерения набора или прибора, выполнить необходимое разведение образца и повторить измерение.
Источники:
- Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. Invitrogen. 2008.
(http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf)
- QuantiFluor™ Handheld Fluorometers Operating Instructions. Technical manual. Promega Corporation. 2011.
- Qubit® dsDNA BR Assay Kits. Manual. Thermo Fisher Scientific Inc. 2015.
(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_BR_Assay_UG.pdf)
- Qubit™ dsDNA HS Assay Kits. Manual. Thermo Fisher Scientific Inc. 2015.
(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf)
- Qubit™ ssDNA Assay Kits. Manual. Thermo Fisher Scientific Inc. 2015.
(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_ssDNA_Assay_UG.pdf)
- Qubit™ RNA Assay Kits. Manual. Thermo Fisher Scientific Inc. 2015.
(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_RNA_BR_Assay_UG.pdf)
Секвенирование по Сэнджеру с помощью капиллярного электрофореза
Используемое оборудование РЦ:
флуориметр для измерения концентрации ДНК, термоциклер BioRad C1000, рутинное оборудование, генетический анализатор ABI3500xl (24-капиллярный) или ABI310 (однокапиллярный).
Принцип метода
Определение нуклеотидной последовательности основано на методе Сэнджера. Продукты ферментативной реакции секвенирования, флуоресцентно меченные дидезоксинуклеотидами, разделяются с помощью капиллярного электрофореза. При достижении полинуклеотидами детекционного окна в капилляре происходит возбуждение лазером флуоресцентной метки и детекция испущенной флуоресценции CCD-камерой. Программное обеспечение анализирует полученные сигналы (хроматограммы) и определяет последовательность нуклеотидов.
Требования к образцам и праймерам
Для секвенирования принимаются образцы ДНК в виде плазмид или ПЦР-фрагментов. В случае ПЦР-фрагмента не должно быть видимой при электрофорезе в агарозном геле примеси нецелевых фрагментов, праймеров и геномной ДНК. Для секвенирования пригодны образцы ДНК, очищенные как с помощью различных "внутрилабораторных" методов, так и коммерческих наборов при условии растворения конечного препарата ДНК в воде.
Количество ДНК для постановки реакции секвенирования рассчитывается исходя из типа матрицы, ее размера и концентрации. Концентрация ДНК может быть определена с помощью спектрофотометра, флуориметра или электрофореза в агарозном геле. В случае плазмидной ДНК на одну ферментативную реакцию секвенирования требуется 50-150 нг с концентрацией ДНК не ниже 20 нг/мкл. В случае ПЦР-фрагментов необходимо 1-2 нг ДНК на каждые 100 п.н. фрагмента, при этом концентрация ДНК должна быть не ниже 2 нг/мкл, а объем – не менее 5 мкл.
Праймеры для секвенирования должны иметь концентрацию 10 пикомоль/мкл, а их объем должен составлять N микролитров, где N – число реакций секвенирования, которое нужно поставить с данного праймера, но не менее 5 мкл.
Протокол метода
Ферментативная реакция секвенирования проводится с помощью набора реактивов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems™) по инструкции к набору и термоциклера BioRad C1000.
Очистка продуктов реакции секвенирования от несвязавшихся флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов выполняется с помощью реактивов BigDye XTerminator® Purification Kit (Applied Biosystems™).
Разделение очищенных продуктов реакции секвенирования проводится методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора ABI3500xl (24-капиллярный) или ABI310 (однокапиллярный) (Applied Biosystems™) в соответствии с рекомендациями к приборам "DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Applied Biosystems Chemistry Guide. Second Edition. 2009".
Результаты секвенирования представляются в виде необработанных и процессированных хроматограмм в стандартных файлах формата *.ab1, которые могут быть открыты и проанализированы бесплатными программами Chromas Lite (http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html) или Sequence Scanner Software (https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=600583&tab=Overview).
Источники:
- Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 74: 5463–5467.
- DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Applied Biosystems Chemistry Guide. Second Edition. 2009. (http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_041003.pdf)
Фрагментный анализ с помощью капиллярного электрофореза
Используемое оборудование РЦ:
генетический анализатор ABI3500xl (24-капиллярный) или ABI310 (однокапиллярный).
Принцип метода
Метод применяется для разделения флуоресцентно меченных фрагментов ДНК с помощью капиллярного электрофореза и определения их размеров и количества. В большинстве случаев мечение фрагментов ДНК происходит в результате ПЦР с флуоресцентно меченными праймерами. Полученные меченные фрагменты ДНК смешиваются с меченным "стандартом длин" и разделяются с помощью капиллярного электрофореза, и на основании полученных хроматограмм программное обеспечение вычисляет размер и относительное количество фрагментов ДНК в образцах.
Требования к образцам
В связи с огромным разнообразием молекулярно-генетических методов, основанных на фрагментном анализе ДНК, в случае каждого конкретного исследования требуется индивидуальный дизайн процедуры приготовления меченных фрагментов ДНК. Вся необходимая информация может быть найдена в руководстве "DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. User Guide. Thermo Fisher Scientific Inc. 2014". Также можно пользоваться рекомендациями производителей коммерческих наборов для генотипирования, предназначенных для использования с приборами ABI3500xl или ABI310 (Applied Biosystems™).
Протокол метода
Анализируемые меченные фрагменты ДНК разбавляются водой в предварительно подобранном соотношении, обеспечивающем оптимальную интенсивность флуоресценции, и смешиваются с формамидом и "стандартом длин" "GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard" или "GeneScan™ 1200 LIZ® Size Standard" (Applied Biosystems™), денатурируются прогреванием в течение 2 мин. при 95ºC и анализируются с помощью генетического анализатора ABI3500xl (24-капиллярный) или ABI310 (однокапиллярный) (Applied Biosystems™) в соответствии с рекомендациями к приборам "DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. User Guide. Thermo Fisher Scientific Inc. 2014".
Результаты электрофореза анализируются с помощью программного обеспечения GeneMapper® (Applied Biosystems™) или GeneMarker® (SoftGenetics, LLC).
Источники:
- Taylor GR, Noble JS, Mueller RF. Automated analysis of multiplex microsatellites. J Med Genet. 1994 Dec; 31(12):937-43.
- Paulus A, Hüsken D. DNA digest analysis with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 1993 Jan-Feb;14(1-2):27-35.
- DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. User Guide. Thermo Fisher Scientific Inc. 2014.
