Методы пробоподготовки к электронной микроскопии

Изготовление стеклянных ножей

Заключение материала в эпоксидную смолу для ультраструктурного исследования

Приготовление цитрата свинца для контрастирования срезов по Reynolds

Замораживание погружением в жидкий этан

Изготовление стеклянных ножей

Используемое оборудование РЦ

Устройство для изготовления стеклянных ножей из полос толщиной до 10 мм Leica EM KMR3.

Описание

Стеклянные ножи используются для изготовления тонких (около 70 нм) и полутонких (до 2000 нм) срезов. 

Реагенты и расходные материалы

Стеклянные полосы.

Протокол изготовление стеклянных ножей

1. 1. Вымыть стеклянную полосу водопроводной водой с мылом, просушить полотенцем. Не тереть, чтобы не сформировался статический заряд.
2. 2. После мытья стекло можно держать только за фабричный скол (длинный) либо пользоваться перчатками.
3. 3. Стекло установить морщинистой стороной вниз на столик прибора, уперев с левой стороны в металлический выступ бегунка. Прижимным рычагом осторожно опустить головку прибора, выровнять стекло, аккуратно постучав головкой по стеклу. Закрепить головку, доведя прижимной рычаг до упора.
4. 4. Установить иконку, соответствующую разрезанию стекла на отрезки.
5. 5. Нажать на кнопку стеклореза.
6. 6. Чтобы расколоть стекло, необходимо установить круглую рукоятку в положение 5 – для стекла толщиной 8 мм, в положение 4 – для стекла толщиной 6 мм.
7. 7. После того, как стекло расколется, выдвинуть каретку, одну из половинок отложить в сторону.
8. 8. Перевести бегунок на 1 шаг ближе к середине столика.
9. 9. Продолжать операции 3-8 до тех пор, пока не будут получены два квадратных отрезка стекла.
10. 10. Один из квадратов отложить в сторону, не поворачивая.
11. 11. Второй, удерживая за фабричный скол, повернуть на четверть оборота по часовой стрелке и установить так, чтобы он уголками попал в углубления на каретке и под головкой прибора.
12. 12. Прижимным рычагом опустить головку, нажать на кнопку стеклореза и медленно вывести круглую рукоять в положение, соответствующее толщине стекла (п. 6), немного не доходя до нужной риски. Стекло должно расколоться в течение 1 мин.
13. 13. Выдвинуть каретку и аккуратно снять ножи, взяв их за боковые стороны. К задней стороне ножей прикасаться нельзя. Режущие кромки у ножей находятся с противоположных сторон. Дуга излома у режущей кромки идет слева сверху направо вниз. Плечо (пяточка) ножа не должно быть больше 2 мм.

Источник

• Сайт производителя:
• http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20EM%20KMR3/Brochures/Leica_EMKMR3_Brochure_EN.pdf
• Обучающее видео производителя:
• http://www.leica-microsystems.com/products/em-sample-prep/biological-specimens/room-temperature-techniques/ultramicrotomy/details/product/leica-em-kmr3/showcase/ 

Заключение материала в эпоксидную смолу для ультраструктурного исследования

Используемое оборудование РЦ

Рутинное оборудование:

• термостат – термостат суховоздушный Binder BD53;
• магнитная мешалка с подогревом BioSan MSH-300;
• шейкер BioSan Multi Bio 3D;
• минирокер-шейкер BioSan MR-1;
• дозаторы одноканальные переменного объёма  2-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл.

Описание метода

Заключение биологического материала в эпоксидную смолу позволяет изучать его на уровне световой и электронной микроскопии. Для световой микроскопии используются срезы толщиной 500-1500 нм, для просвечивающей электронной – 60-80 нм. Для заключения в эпоксидную смолу материал должен быть предварительно обезвожен. Эпоксидные смолы обычно не используются для иммунолокализации.

Реагенты и расходные материалы:

• фиксатор (обычно глутаровый альдегид или смесь глутарового альдегида и параформальдегида);
• тетраоксид осмия;
• буферный раствор;
• спирт;
• ацетон;
• эпоксидная смола;
• пастеровские пипетки;
• наконечники для дозаторов;
• эппендорфы, пенницилинки или виалы.

 Протокол заключения в эпоксидную смолу фрагментов тканей.

1. 1. Фрагменты ткани или органа отрезать острым лезвием (бритвой или скальпелем), поместить в охлажденный фиксирующий раствор и разрезать на кусочки объемом около  1-2 мм³. Кусочки поместить в пробирки с фиксатором, разведенном на буфере, для дальнейшей обработки на 1-16 ч. в зависимости от температуры фиксации.
2. 2. Материал промыть буфером 4 раза по 5-15 мин. Отмытый материал можно хранить в холодильнике до 2 недель.
3. 3. Постфиксировать материал в 0.5-2% растворе OsO₄ 45 мин.-2 ч. при комнатной температуре или до 16 ч. при +4^оС.
4. 4. Материал промыть буфером и/или водой 3-4 раза по 5-10 мин. Отмытый материал можно хранить в холодильнике 1-2 дня.
5. 5. Материал можно дополнительно контрастировать 0.5-2.5% раствором ацетатом урана на воде 30 мин., хорошо отмыв водой после постфиксации тетраоксидом осмия или 0.5-2.5% раствором ацетатом урана на 70% этаноле 30-90 мин. во время обезвоживания после 70% спирта.

Для обезвоживания провести материал через серию спиртов возрастающих концентраций (30%), 50%, 70%, 95%, инкубируя в каждом растворе по 5-10 мин., смесь спирт:ацетон в соотношении 1:1 два раза по 5-10 мин., обезвоженный ацетон 2 раза по 5-10 мин. Обезвоживание и последующее заключение в смолу лучше проводить на качалке BioSan Multi Bio 3D или BioSan MR-1.

1. 6. Для заключения в эпоксидную смолу провести материал через серию разведений смолы в ацетоне (10%), 30%, 50%, 70%, 100%, увеличивая время инкубации в каждой смоле от 15-30 мин. до 1-4 ч. В последней смоле можно выдержать 16 ч. (ночь).

Растительный материал часто обезвоживают только в ацетоне (30-50-70%, три смены 100% ацетона).

Можно ацетон заменить или дополнить оксидом пропилена по рекомендации производителя смолы.

1. 7. Переложить материал в свежую смолу (разложить по ванночкам или капсулам) для полимеризации. Выдеражать ночь при комнатной температуре или при 45°С.
2. 8. Полимеризовать блоки согласно указаниям производителя смолы. Для придания готовым блокам большей твердости можно после извлечения из термостата их поместить на короткое время в морозилку, для придания большей пластичности – выключить термостат и оставить в нем блоки до полного остывания.

Источник

• A. Mascorro and J. J. Bozzola. Processing Biological Tissues for Ultrastructural Study // Electron microscopy : methods and protocols. – 2nd ed. / edited by John Kuo. p. 19-34.

Приготовление цитрата свинца для контрастирования срезов по Reynolds

Используемое оборудование РЦ

Рутинное оборудование:

• весы прецизионные Ohaus Adventurer Pro OH-AV413C.

Описание метода

Контрастирование срезов на сетках позволяет визуализировать элементы ультраструктуры в просвечивающем электронном микроскопе. Метод приготовления цитрата свинца для контрастирования, предложенный Рейнолдсом (Reynolds, 1963), позволяет получить стабильный при хранении раствор.

Реагенты и расходные материалы:

• нитрат свинца тригидрат;
• цитрат натрия;
• едкий натр;
• мерная колба на 50 мл;
• пастеровские пипетки.

Приготовление цитрата свинца для контрастирования срезов по Reynolds

1. 1. Воду освободить от углекислого газа (вскипятить, остудить до 40°С).
2. 2. Нитрат свинца 1.33 г, цитрат натрия 1.76 г всыпать  в мерную колбу на 50 мл, смешать, влить 30 мл теплой воды и встряхивать 30 мин., первые 10 мин. интенсивно.
3. 3. Добавить 8 мл свежеприготовленного 1 н раствора NaOH. Раствор солей в колбе станет прозрачным.
4. 4. Довести до 50 мл водой.
5. 5. Хранить в холодильнике.

Источники

• 1. Reynolds E. S. The use of lead citrate at high ph as an electron-opaque stain in electron microscopy // The Journal of Cell Biology.  1963. V. 17 No 1 P. 208–212.
• 2. E.A. Ellis. Poststaining Grids for Transmission Electron Microscopy: Conventional and Alternative Protocols // Electron microscopy: methods and protocols. – 2nd ed. / edited by John Kuo. p. 97-106.

Замораживание погружением в жидкий этан

Используемое оборудование РЦ

Leica EM GP

Описание метода

Замораживание погружением в жидкий этан – это один из способов заморозки, содержащих воду препаратов, позволяющих минимизировать образование кристаллов водного льда, разрушающих структуру образца. Используется наряду с доступными в РЦ методами заморозки под давлением и заморозки в азотном льду.

Реагенты и расходные материалы:

• сжатый этан,
• жидкий азот,
• сеточки с перфорированным углеродным покрытием,
• фильтровальная бумага,
• носики для пипеток.

Протокол для заморозки на сеточках:

1. 1. Заполнить Leica EM GP жидким азотом, заполнять камеру этаном, давая ему сконденсироваться при температуре жидкого азота.
2. 2. Приготовить 1.2 мкл раствора для нанесения на сеточку.
3. 3. Нажать Load Forceps. Зажать сеточку с перфорированным углеродным покрытием в специальном пинцете, пинцет укрепить на стержне для окунания.
4. 4. Снять крышку камеры с жидким азотом, если она была надета. Нажать Lower Chamber.
5. 5. Открыть окошко сбоку камеры, через него нанести пипеткой раствор на одну сторону сеточки.
6. 6. Нажать Blot, фильтровальная бумага должна прижаться к противоположной стороне сетки и полностью впитать жидкую часть раствора. (Если операция Blot оставляет на сетке непромокнутые капли можно сделать всё вручную, внеся пинцетом кусочек фильтровальной бумаги через окно в противоположной стороне камеры).
7. 7. Нажать Plunge.
8. 8. Нажать Transfer.
9. 9. Снять пинцет со стержня. (Осторожно: не ударьте сетку об дно камеры, не доставайте сетку выше края камеры с азотом, вынеся сетку из чистых паров азота вы покроете её изморозью, или растопите раствор на воздухе.)
10. 10. Аккуратно положить сетку в круглый бокс для сеток (решите в какую сторону всегда будет смотреть лицевая сторона сетки), завинтить крышку.
11. 11. Для хранения: переместить круглый бокс под слой жидкого азота, затем отнесите в криохранилище (помните что круглый бокс на воздухе прогревается за несколько секунд, держите всё рядом, заранее охлаждайте пинцет).
12. 12. Для работы: переместить круглый бокс в камеру Gatan 914, заполненную жидким азотом, перенесите сетку в держатель микроскопа, закройте шторку для защиты от водной изморози.

Источник

• Официальный мануал фирмы Leica – Leica EM GP.pdf