Методы проточной цитометрии

Комплекс методов проточной цитометрии позволяет измерять физические и химические параметры отдельных клеток или частиц. Он основан на регистрации флуоресценции и светорассеяния от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в струе жидкости. Методы проточной цитометрии чаще всего применяется при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. Также можно исследовать диссоциированные клетки любых тканей, дрожжевые клетки, бактериальные клетки, микропланктон, флуоресцентные микросферы с зондами.

Комплекс методов проточной цитометрии включает:

  1. 1. Анализ клеток и частиц:
  • - идентификация отдельных классов, подклассов, популяций, субпопуляций путем измерения их поверхностных и/или внутриклеточных маркеров;
  • - оценка функционального состояния клеток (митохондриальный потенциал, внутриклеточный кальций, pH) с использованием специальных ратиометрических красителей (FDA, DiOC1, JC -1 и др.);
  • - оценка функционального состояния клеток с помощью специфических антител к фосфорилированным и не-фосфорилированным формам изучаемых белков;
  • - многопараметрический (многоцветный) анализ проб;
  • - анализ параметров клеточного цикла и содержания ДНК в живых и фиксированных клетках;
  • - изучение кинетических параметров клеточных процессов (повреждение клеточных мембран, ферментативная активность);
  • - исследование механизмов и стадий апоптоза с использованием разнообразных маркеров и зондов;
  • - изучение фагоцитоза, в том числе в нейтрофилах крови и макрофагах;
  • - исследование чувствительности клеток к цитостатикам путем определения уровня экспрессии белков (P-gp и др.);
  • - молекулярно-генетические исследования (изучение отдельных хромосом и экспрессии генов);
  • - проточное кариотипирование хромосом с использованием флуоресцентных зондов.
  1. 2. Сортировку клеток и частиц:
  • - сортировка до 4 фракций в соответствии с проведенным гейтированием;
  • - сортировка единичных клеток в культуральные и/или ПЦР-планшеты. 
  •  

Цитометрический анализ клеточного цикла

Цитометрический анализ апоптотической (программируемой) клеточной гибели: AnnexinV-FITC/PI

Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии

Сортировка единичных клеток (single cell sorting)

 

Цитометрический анализ клеточного цикла

Используемое оборудование РЦ:

  • проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток BD FACSAriaIII;
  • рутинное оборудование.

Описание метода:

Анализ клеточного цикла – один из методов изучения пролиферативной активности клеток. С помощью метода исследуются фазы клеточного цикла: оценивается распределение клеток по G1/G0-, S- и G2/M-фазам клеточного цикла путем определения относительного содержания ДНК в клетках при помощи ДНК-связывающих флуоресцентных красителей, таких как PI (йодистый пропидий), 7-AAD (7-аминоактиномицин), DAPI (4’6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), Hoechst, SybrGreen и др. С помощью данного метода можно анализировать только клеточные суспензии, что является одним из ограничительных факторов метода.

Метод используется как в научных, так и в клинических исследованиях, например,:

  • - выявление высоко пролиферирующих популяций клеток;
  • - выявление анеуплоидных популяций клеток;
  • - анализ эффектов лекарственных препаратов.

Вариации метода:

- использование различных красителей ДНК:

  • 1). Красители, проникающие через плазматическую мембрану и мембрану ядра, предназначенные для окрашивания живых клекток.
  • 2). Красители, не проникающие через мембраны ядра, требующие предварительной обработки клетки: фиксации и/или пермеабилизации;

- в случае необходимости фиксации и/или пермеабилизации использование разных агентов:

  • 1). Использование спиртов (этанола) – одновременно и фиксирующего, и пермеабилизирующего агента. Использование спиртов обеспечивает легкий доступ красителя в ядро, а также хорошие характеристики анализируемого сигнала – низкий коэффициэнт вариации (CV). Однако, часто использование спиртов несовместимо с использованием флуоресцентных красителей. Фиксированные спиртом клетки стабильны в течение нескольких недель при температуре 4°C.
  • 2). Использование альдегидов (параформальдегида) – фиксирующего агента. Использование альдегидов позволяет одновременную (синхронную) детекцию различных флуорохромов и мембран-связанных протеинов. Однако, использование альдегидов приводит к ухудшению характеристик анализируемых сигналов (высокий коэффициент вариации), а также в большинстве случаев альдегиды только фиксируют, но не пермеабилизируют мембраны, что приходит к необходимости применять дополнительные пермеабилизирующие агенты, такие как Triton X-100 (0.1%) и др. Фиксированные альдегидом клетки стабильны в течение двух-трех дней при температуре 4°C.

Протокол анализа клеточного цикла с помощью проточной цитометрии путем окрашивания ДНК йодистым пропидием (PI)

- Реагенты:

  • 70% этонол,
  • йодистый пропидий (исходный раствор 50 мкг/мл),
  • рибонуклеаза I (исходных раствор 100 мг/мл).

- Протокол:

  • 1). Собрать клетки в пробирку и отмыть несколько раз в PBS.
  • 2). Провести фиксацию клеток в холодном 70% этаноле: Осадить клетки; удалить буфер; перемешивая клетки на вортекте, медленно добавлять этанол. Таким образом происходит фиксация всех клеток и предотвращается образование слипшихся масс. Оставить фиксироваться клетки в этаноле на 30 мин при 4°C.
  • 3). Отмыть клетки от этанола в PBS (2 раза): отцентрифугировать клетки на скорости 850 g, осторожно слить супернатант, избегая потери клеток, особенно после первой отмывки от этанола. Оставить часть клеток в качестве отрицательного контроля (неокрашенные клетки).
  • 4). Обработать клетки рибонуклеазой I: добавить 50 мкл исходного раствора рибонуклеазы I (100 мг/мл). Это обеспечит связывание только ДНК с красителем, но не РНК.
  • 5). Добавить 200 млк исходного раствора PI (100 мг/мл).

- Анализ образца на проточной цитрфлуориметре:

  • 1) Настроить прибор с помощью неокрашенных клеток.
  • 2) Найти и гейтировать исследуемый образец на гистограмме FSC-A (прямое светорассеяние) против SSC-A (боковое светорассеяния).
  • 3) Отделить синглеты на гистограмме SSC-H (высота сигнала бокового светорассеяния) против SSC-W (ширина сигнала бокового светорассеяния).
  • 4) Провести анализ фаз клеточного цикла на гистограммах FSC-A против PI; PI-W (ширина сигнала флуоресценции PI) против PI-A (площадь) сигнала флуоресценции PI); PI против количества клеток.

Источник

  • M.G. Ormerod, B. Tribukait, Walter Giaretti. Consensus report of the task force on standardisation of DNA flow cytometry in clinical pathology// Analytical Cellular Pathology. (Hindawi Publishing Corporation) 1998, v.17, № 2, p.103-110.
  • Кудрявцев И.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в экспериментальной биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2012, 192 с.

 

Цитометрический анализ апоптотической (программируемой) клеточной гибели: AnnexinV-FITC/PI

Используемое оборудование РЦ:

  • проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток BD FACSAriaIII;
  • рутинное оборудование.

Описание метода:

Цитометрический анализ апоптотической (программируемой) клеточной гибели с помощью AnnexinV-FITC/PI – один из комплекса методов исследования апоптоза с помощью проточной цитометрии. AnnexinV-FITC/PI – самый распространенный и легко воспроизводимый тест для исследования апоптоза клетки, который, однако, не заменяет другие тесты, и для получения полноценных данных применяется в комплексе с ними.

Апоптотическая гибель клетки состоит из 4 основных стадий: 1) Начальная стадия – индукция (внешний или внутрений пути) – обратимая стадия. 2) Первые видимые события: митохондриальная "катастрофа" – пермеабилизация наружной мембраны и сброс потенциала; нарушение калий-натриевого баланса и съеживание клетки. 3) Промежуточные события: активация каспаз и экстернализация фосфатидилсерина; нарушение проницаемости плазматической мембраны. 4) Поздние события: деградация ДНК, конденсация и затем фрагментация ядра, полная пермеабилизация плазматической мембраны; распад клетки. С помощью описываемого метода (AnnexinV-FITC/PI) можно разделить клетки на живые клетки (влючает живые клетки и клетки на первой и второй стадиях апоптоза), апоптотичесчкие клетки (третья и частично четвертая стадии апоптоза) и вторичные некротические клетки. Метод основан на:

  • - регистрации изменений архитектуры наружной плазматической мембраны клетки на третьей стадии апоптоза. В нормальных живых клетках фосфолипид фосфатидилсерин находится во внутреннем слое мембраны клетки, в то время как в наружном слое мембраны он представлен в минимальных количествах. На третьей стадии апоптоза фосфатидилсерин экстернализуется из внутреннего слоя мембраны в наружный. В присутствии ионов Ca2+ AnnexinV специфично связывается с фосфатидилсероном, находящемся в наружном слое мембраны, и конъюгированный с флуоресцентной меткой (FITC) он позволяет определить начало 3 стадии апоптоза;
  • - неспособности PI входить в живые клетки, а также в клетки с нетронутой наружной плазматической мембраной. PI начинает входить в клетки только в конце третьей стадии апоптоза после того, как целостность наружной мембраны нарушается. Таким образом, используя конъюгат AnnexinV-FITC в комбинации с ДНК красителем PI, можно разделить исследуемый образец на 4 популяции:
  •    популяция условно живых клеток: негативный сигнал от обоих красителей (FITC-/PI-);
  •    популяция клеток на ранней/ средней стадии апоптоза: позитивный сигнал FITC и негативный сигнал PI (FITC+/PI-);
  •    популяция клеток на поздней стадии апоптоза / условно некротические клетки: позитивный сигнал FITC и позитивный сигнал PI (FITC+/PI+);
  •    некротические клетки / остатки клеток: негативный сигнал FITC и позитивный сигнал PI (FITC-/PI+).

Ограничения анализа апоптотической (программируемой) клеточной гибели с помощью AnnexinV-FITC/PI: исследование апоптоза только на живых (нефиксированных) клетках в суспензии.

Протокол цитофлуориметрического анализа апоптоза клеток с помощью AnnexinV-FITC/PI метода:

- Реагенты:

  • связывающий буфер (10 mM HEPES/NaОН pH7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2),
  • FITC-Annexin V,
  • PI (исходный водный раствор 400 мг/мл йодистого пропидия, 4°C).

- Протокол:

  • 1). Приготовить суспензию клеток с концентрацией 106/мл, отмыть в PBS 2 раза.
  • 2). Осадить клетки центрифугированием, удалить буфер, ресуспензировать клетки в связывающем буфере.
  • 3). Добавить конъюгат AnnexinV-FITC в конечной концентрации 1мг/мл клеточной суспенции. Инкубировать 10 мин. в темноте при комнатной температуре.
  • 4). Добавить PI в конечной концентрации 2 мг/мл клеточной суспенции. Продолжить инкубацию еще 5 мин.

Для корректного анализа также необходимо приготовить контроли:

  • - отрицательный контроль для настройки прибора (неокрашенные клетки);
  • - клетки, окрашенные только конъюгатом AnnexinV-FITC, и клетки, окрашенные только PI, для настройки компенсации;
  • - в качестве положительного контроля можно провести окраску клеток без использования Ca2+-содержащего буфера.

- Анализ окрашенных клеток на проточной цитрфлуориметре:

1). Настроить прибор с помощью неокрашенных клеток, а также остальных контролей.

2). Найти и гейтировать исследуемый образец на гистограмме FSC-A (прямое светорассеяние) против SSC-A (боковое светорассеяния).

3). Отделить синглеты на гистограмме SSC-H (высота сигнала бокового светорассеяния) против SSC-W (ширина сигнала бокового светорассеяния).

4). На гистограмме FITC-A (площадь сигнала флуоресценции FITC) против PI-A (площадь сигнала флуоресценции PI) разделить клетки на 4 популяции и провести дальней анализ выделенных популяций (определить процентное содержание каждой популяции). При этом необходимо помнить, что в процессе пробоподготовки исследуемые клетки могут также уходить в апоптоз, индуцированный сторонними воздействиями. Поэтому после первичной (экспериментальной) индукции апоптоза необходимо как можно скорее провести анализ клеток на проточном цитофлуориметре. Также необходимо учитывать, что начальные стадии апоптоза – обратимые, поэтому цитофлуориметрический анализ апоптоза клеток с помощью AnnexinV-FITC/PI метода необходимо повторять несколько раз для получения достоверных воспроизводимых результатов.

Источники

  1. I. Vermes, C. Haanen, C. Reutelingsperger. Flow cytometry of apoptotic cell death// Journal of Immunological Methods. V. 243, Issues 1-2, 2000, p. 167-190.
  2. I. Vermes, C. Haanen, H. Steffens-Nakken, C. Reutelingsperger. A novel assay for apoptosis. Flow cytometic detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V// J. Immunol. Methods, 184 (1995), p. 39.
  3. Кудрявцев И.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в экспериментальной биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2012, 192 с.

 

Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии

Используемое оборудование РЦ:

  • проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток BD FACSAriaIII;
  • рутинное оборудование.

Описание метода:

Иммунофенотипирование – анализ гетерогенной популяции клеток с целью выявления наличия и соотношения популяций интереса путем анализа поверхностных и внутриклеточных антигенов (маркеров), экспрессируемых клетками. Выявление и анализ антигенов производится с помощью конъюгированных с флуорохромами антител путем детекции флуоресцентного сигнала проточным цитофлуориметром. В качестве антигенов чаще всего используются функциональные протеины мембран, вовлеченные в клеточную коммуникацию, адгезию и метаболизм.

В научных и клинических исследованиях применяется, прежде всего, фенотипирование клеток крови и костного мозга с помощью мультипараметрического (многоцветного) анализа поверхностных CD маркеров. Данный метод позволяет разделить клетки на популяции клеток с различными фенотипами (как известными в литературе, так и новыми, еще неисследованными ранее), анализируя интенсивность сигналов исследуемых флуоресцентных маркеров. Проточный цитофлуориметр с тремя лазерами в конфигурации 3-6-3 полосных фильтра позволяет одновременно регистрировать до 11 флуоресцентных маркеров.

Вариации метода:

  • - анализ поверхностных и/или внутриклеточных маркеров;
  • - анализ живых / фиксированных клеток;
  • - использование разных протоколов окрашивания (с помощью конъюгатов первичных антител / с помощью конъюгатов вторичных антител).

Общий протокол для иммунофенотипирования с использованием конъюгатов первичных антител

- Протокол:

  • 1). Собрать, отмыть клетки и развести их в концентрации 1-5x106 клеток/мл в холодном буфере PBS (с добавлением 10% FCS, 1% азида натрия).
  • Рекомендуется работать с клетками при температуре 4°C, используя охлажденные реактивы и в присутствии азида натрия для предотвращения модуляции и интернализации поверхностных антигенов.
  • 2). Добавить 0.1-10 мг/мл первичных антител, конъюгированных с флуорохромами. При необходимости разводить антитела можно в 3% растворе BSA/PBS. Также можно добавить йодид пропидия для исключения мертвых клеток.
  • 3). Инкубировать антитела как минимум 30 мин при комнатной температуре или при температуре 4°C (в зависимости от используемых антител).
  • 4). Отмыть клетки 3 раза с помощью центрифугирования на 400 g 5 мин. и развести их в 500-1000 мкл холодного PBS (с добавлением 10% FCS, 1% азида натрия). Держать клетки необходимо в темноте на льду. Провести анализ клеток на проточной цитометре рекомендуется как можно быстрее после завершения окраски. Если требуется время между окрашиванием и анализом рекомендуется произвести фиксацию клеток после пункта 3.

Для корректного анализа образца необходимо приготовить также контроли: отрицательный контроль (неокрашенные клетки), изотипический контроль (клетки, окрашенные каждым флуорохромом отдельно (при окраске образца более чем одним красителем), для настройки компенсации).

- Анализ окрашенных клеток на проточной цитрфлуориметре:

  • 1). Настроить прибор, используя неокрашенные клетки и необходимые контроли.
  • 2). Найти и гейтировать исследуемый образец на гистограмме FSC-A (прямое светорассеяние) против SSC-A (боковое светорассеяния).
  • 3). Отделить синглеты на гистограмме SSC-H (высота сигнала бокового светорассеяния) против SSC-W (ширина сигнала бокового светорассеяния).
  • 4). Разделить клетки интереса на отдельные популяции и проанализировать их в соответствии с интенсивностью флуоресценции исследуемых маркеров на соответствующих гистограммах FL1/FL2 и т.д.
Источники
  • 1. Stewart CC, Nicholson JKA, editors. Immunophenotyping. New York: Wiley-Liss; 2000.
  • 2. Robinson JP, Darzynkiewicz Z, Hyun W, Orfao A, Rabinovitch P, editors. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; 2004.
  • 3. Gutensohn K, Sonneborn HH, Kuhnl P, editors. Aspects of the flow cytometric analysis of red blood cells. Heidelberg: Clin Lab Publications; 1997.

Сортировка единичных клеток (single cell sorting)

Используемое оборудование РЦ:

  • проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток BD FACSAriaIII;
  • рутинное оборудование.

Описание метода

Данный метод предоставляет возможность рассортировать клетки по 1 шт. в каждую лунку культуральных и ПЦР-планшетов в соответствии в проведенным гейтированием по исследуемым клеточным маркерам. Сортировка единичных клеток применяется, прежде всего, для последующего культивирования (получения чистых клеточных линий от одной клетки) или для последующего генетического анализа (проведения ПЦР одной клетки). Сортировка единичных клеток отличается от стандартной сортировки особой настройкой проточного цитофлуориметра-сортировщика клеток таким образом.

  • Необходимо сортировать в оптимальных биологических условиях:
- использовать чистый PBS вместо стандартной проточной жидкости,
- использовать соппл большого диаметра (100-130 мкм),
- использовать только низкое давление (10-20 psi).
  • Необходимо очень точно настроить сортировку капли в центр лунки. Кроме того, при сортировки в ПЦР-планшеты и при отсутствии специального держателя для ПЦР-планшетов на используемом цитометре: необходимо поместить ПЦР- планшеты в культуральные плоскодонные планшеты, убедиться, что между ними нет люфта (ПЦР-планшеты должны плотно входить в культуральные и не смещаться в них) и плотно закрепить последние в держателе цитометра.
  • Необходимо убедиться, что в лунках планшета, в который будет производиться сортировка, налит буфер (или ПЦР-мастер микс) в достаточном объеме, предотвращающем высыхание одной отсортированной клетки в лунке планшета.
  • Необходимо использовать очень точную маску сортировки со следующими значениями: маска чистоты (purity mask) = 32, фазовая маска (phase mask) = 16, урожайная маска (yield mask) = 0.
Источники
  • 1. Battye F.L., Light A., Tarlinton D.M. Single cell sorting and cloning // J. Immunol Methods. 2000; 243 (1-2), p. 25-32.
  • 2. Инструкция BD FACSAriaIII.