Методы анализа метаболитов растительного и животного происхождения

 

Установленное оборудование для газовой хромато-масс-спектрометрии позволяет проводить анализ таких веществ, как:

  • - сахара и их производные,
  • - аминокислоты,
  • - другие органические кислоты,
  • - гормоны растений (ауксин, салициловая кислота, этилен, абсцизовая кислота),
  • - воски (сложные эфиры высших жирных кислот и высшие высокомолекулярные спирты).

Установленное оборудование для жидкостной хромато-масс-спектрометрии позволяет проводить анализ:

  • - белков,
  • - пептидов (пептидные гормоны, цитокины, тахикины),
  • - глюкозинолатов,
  • - фенольных производных. 

Анализ компонентного состава эфирных масел с помощью двумерной газовой хроматографии

GC-MS – метаболомный анализ асцитных жидкостей

Анализ метиловых эфиров жирных кислот

 

Анализ компонентного состава эфирных масел с помощью двумерной газовой хроматографии

Используемое оборудование РЦ:

  • двумерный газовый хроматограф-масс-спектрометр LECO Pegasus 4D в режиме GC x GC-TOF;
  • виалы для автосамплера, завинчивающиеся крышки, септы.

Описание метода

Метод позволяет более детально характеризовать смеси  летучих фитогенных соединений, полученных гидродистилляцией растительного сырья. Может также использоваться для исследования и контроля препаратов, используемых в ароматерапии и для исследования аллелопатических связей, реализуемых посредством летучих соединений.

Растворители: гексан или хлороформ.

Подготовка пробы заключается в растворении предоставленного для анализа образца в хлороформе или гексане в концентрации 1 мг/мл. В случае образования осадка он удаляется фильтрованием через бумажный фильтр.

При получении эфирного масла методом гидродистилляции возможно наличие в пробе остатков воды. В этом случае проба высушивается добавлением безводного сульфата натрия с последующим фильтрованием.

Условия проведения анализа:

  • газ-носитель – гелий. Режим постоянства потока – 1 мл/мин.
  • Температура испарителя – 250°С. Работа со сбросом газового потока – 1:50.
  • Колонка – BPX-5 (Supelco), 30 м х 0.25 мм. Пленка неподвижной фазы – 0.25 мкм.
  • Линейное программирование температуры – от 70оС до 270°С со скоростью 4°С/мин.
  • Вторичная колонка – BPX-50 (SGE) 1.5 м х 0.1 мм. Пленка неподвижной фазы – 0.1 мкм.
  • Линейное программирование температуры – от 75оС до 275°С со скоростью 4°С/мин.
  • Превышение температуры термомодулятора – 15 °С.
  • Цикл термомодуляции – 4 с.
  • Длительность импульса нагрева – 1.3 с.
  • Температура зоны сопряжения с детектором – 250°С.
  • Масс-спектрометрический детектор с ионизацией электронным ударом и времяпролетным анализатором.
  • Стандартная энергия ионизации – 70eV.
  • Диапазон сканирования – 50-500 mZ.
  • Скорость сканирования – 100 спектров/с.

Сбор и обработка данных в режиме автоматической деконволюции и идентификации соединений с использованием масс-спектрометрической библиотеки NIST10.

Квантирование методом нормализации и визуализация результатов и помощью штатного программного обеспечения ChromTOF®.

Источник:

Буданцев, А. Л., & Шаварда, А. Л. (2013). Анализ эфирного масла Dracocephalum oblongifolium (Lamiaceae) с использованием полной двумерной хроматографии. Растительные ресурсы, 49 (1), 107–117.

 

GC-MS – метаболомный анализ асцитных жидкостей

Используемое оборудование РЦ:

  • газовый хроматограф-масс-спектрометр LECO Pegasus 4D в режиме GC – TOF;
  • вакуумный концентратор CentriVac Labconco;
  • виалы для автосамплера, завинчивающиеся крышки, септы.

Описание метода:

Пример реализации нецелевого метаболомного анализа, основанного на использовании GC-MS хроматографии модифицированного метаболитного пула.  Метод может быть использован для метаболомных исследований любых биологических объектов в области малых молекул, способных образовывать производные достаточно летучие для газо-хроматографического анализа. (фенольные соединения, органические кислоты, спирты, амины, аминокислоты, моно- и дисахариды и их производные и т.п.).

Реактивы: бис-триметилсилилацетамид (BSTFA) (Fluka), пиридин.

Стандартный раствор трикозана (Sigma) в пиридине в концентрации 1000 ppm (1 мг/мл).

Подготовка пробы

Главное требование к объекту при подготовке пробы – полное отсутствие воды, белков, полисахаридов и других макромолекул. Поэтому для анализа требуется лиофилизированный образец, обработанный метанолом или ацетонитрилом для высаживания большей части макромолекул.

Супернатант (1 мл.) после обработки лиофилизированной биологической жидкости метанолом или ацетонитрилом помещается в стандартную виалу и растворитель удаляется в вакуумном концентраторе.

В виалу добавляется 20-100 мкл. внутреннего стандарта (1000 ppm трикозана в пиридине).

Объем добавленного стандарта диктуется предполагаемым уровнем содержания метаболитов в пробе.

Протокол получения триметилсилильных производных.

1 вариант. В виалу с аналитом и стандартом добавляется 20 мкл. BSTFA. Виала плотно закрывается и помещается в термостат при 100 °С на 15 мин.

2 вариант. Возможно использование программируемого автосамплера Gerstel, которым оснащен Pegasus 4D для организации автоматического процесса силилирования. В этом случае в автосамплер загружаются виалы с пробами и добавленным стандартом. Добавление реагента и термостатирование перед запуском в хроматограф осуществляется автоматически.

Условия проведения анализа

  • Газ-носитель – гелий.
  • Режим постоянства потока – 1 мл/мин.
  • Температура испарителя – 300 °С.
  • Работа со сбросом газового потока – 1:20.
  • Колонка: BPX-5 (Supelco) 30 м х 0.25 мм. Пленка неподвижной фазы – 0.25 мкм.
  • Линейное программирование температуры – от 70оС до 320°С со скоростью 6°С/мин., 15 мин изотермы.
  • Вторичная колонка: BPX-50 (SGE) 1.5 м х 0.1 мм. Пленка неподвижной фазы – 0.1 мкм.
  • Линейное программирование температуры – от 75оС до 325°С со скоростью 6°С/мин.
  • Термомодулятор не используется.
  • Температура зоны сопряжения с детектором – 250 °С.
  • Масс-спектрометрический детектор с ионизацией электронным ударом и времяпролетным анализатором.
  • Стандартная энергия ионизации – 70eV.
  • Диапазон сканирования – 50-1000 mZ.
  • Скорость сканирования – 2 спектра/с.

Полученные хроматограммы конвертируются в формат AIA (netCDF) для возможности использования программного обеспечения AMDIS и UniChrom, облегчающего построение метаболомных матриц.

Квантирование метаболомного профиля проводится по полному ионному току методом внутреннего стандарта без учета коэффициентов чувствительности (semi-quant).

Источник:

Shender, V. O., Pavlyukov, M. S., Ziganshin, R. H., Arapidi, G. P., Kovalchuk, S. I., Anikanov, N. A., … Govorun, V. M. (2014). Proteome-metabolome profiling of ovarian cancer ascites reveals novel components involved in intercellular communication. Molecular & Cellular Proteomics : MCP, 13(12), 3558–3571. doi:10.1074/mcp.M114.041194

 

Анализ метиловых эфиров жирных кислот

Используемое оборудование РЦ:

  • двумерный газовый хроматограф-масс-спектрометр LECO Pegasus 4D в режиме GC x GC-TOF;
  • виалы для автосамплера, завинчивающиеся крышки, септы.

Описание метода

Двумерная реализация FAME- анализа. Позволяет идентифицировать транс-изомеры жирных кислот и различать расположение двойных связей.

Одна из методик, специально разработанная специалистами компании LECO для использования двумерного хроматографа Pegasus 4D.

Использование GCxGC-TOFMS метода существенно расширяет возможности обычного газо-хроматографического анализа метиловых эфиров жирных кислот не только за счет повышения эффективности разделения аналитов, но и предоставляет дополнительные возможности для их идентификации. Локализация разделенных соединений на двумерной хроматограмме образует корреляционные паттерны для насыщенных жирных кислот по временной оси для главной хроматографической колонки (длина углеродной цепи, или летучесть) и для ненасыщенных по оси вторичной хроматографии (число и характер двойных связей, или полярность). Это позволяет обнаружить большее число изомеров в анализируемом объекте и делать заключения о структуре кислоты исходя из ее положения на двумерной хроматограмме при отсутствии референсной MS или RI информации или стандартного соединения.

Подготовка пробы

  • Гидролиз пробы с целью высвобождения жирных кислот и получение метиловых эфиров в РЦ не предусмотрены.
  • Условия анализа.
  • GC параметры – LECO Pegasus 4D с термомодулятором и вторичным термостатом.
  • Инжекция – 1 мкл. Сброс 1:50 в 250°С.
  • Первичная колонка: DB-5MS 30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм (Agilent).
  • Вторичная колонка: BPX-50 2 м х 0.1 мм х 0.1 мкм (SGE).
  • Газ-носитель – гелий, 1 мл/мин., постоянный поток.
  • Температура первичного термостата: 40°С, 2 мин., 30°С/мин. до 160°С, 2°С до 300°С, 5 мин. изотерма.
  • Температура вторичного термостата: 45°С, 2 мин., 30°С/мин. до 165°С, 2°С до 305°С, 5 мин. изотерма.
  • Перегрев  термомодулятора – 30°С.
  • Время модуляции – 5 с.
  • Горячий импульс – 1 с.
  • Transfer Line – 250°С.
  • Время анализ – 83.5 мин.
  • MS параметры – LECO Pegasus 4D GCxGC-TOFMS
  • Ионизация – EI, 70 eV.
  • Температура источника – 220°С.
  • Диапазон масс сканирования – 45-650.
  • Скорость сбора данных – 100 спектров/с.

Обработка, квантирование и визуализация результатов с помощью программного обеспечения ChromTOF®.

Источник:

LECO Application Notes: http://www.leco.com/support/application-support-separation-sciences/app-notes-separation-science?view=category&id=144