Методики РЦ КМ

Культуры поддерживаются в стеклянных пробирках объемом 14 или 16 мл при температуре  10˚С. Среда для культивирования: 0,04 % отвар салатных листьев на дистиллированной воде, инкубированный с пищевыми бактериями. Кормление культур инкубированной салатной средой производят раз в две недели с частичной или полной заменой среды.

Культуры поддерживаются в стеклянных чашках Петри диаметром 90 мм или бактпечатках, при температуре 18˚С. Среда для культивирования Прескотт-Карриер, пищевые объекты – инфузории Tetrahymena pyriformis. Кормление культур и смена среды через день, пересадка со сменой среды раз в неделю. Возможно поддержание культур на среде Прескотта-Карриера с  рисовыми зернами и инокулированной в среду смесью инфузорий Colpidium sp. и жгутиконосцев Chilomonas sp. 

Культуры поддерживаются в культуральных флаконах объемом 50мл или чашках Петри диаметром 60 или 90 мм, при температуре 18˚С. Среды для культивирования:

Штаммы коллекции поддерживаются в виде растущих или покоящихся культур на жидких или агаризованных синтетических питательных средах.

Основные питательные среды 1, 3, 6, 12, 16 и 17 разработаны в лаборатории микробиологии (Громов Б.В., Титова Н.Н, 1983).

  1. 1. Образец природной воды с находящимися в ней микроорганизмами тщательно обследуют под бинокуляром. В микроаквариум («солонку») вносят 0.5-1 мл исследуемой воды без инфузорий. С помощью капиллярной пипетки отбирают клетки парамеций и помещают в микроаквариум.
  2. 2. Клетки парамеций необходимо отмыть от сопутствующих микроорганизмов. Для этого с помощью капиллярной пипетки клетки из исходного микроаквариума переносят по одной в микроаквариум с бактериальной средой, используемой для кормления парамеций (0.5-1 мл). Процедуру повторяют еще 2-4 раза.

  1. 1. Образец донного грунта и/или воды из водного экотопа отбирают в стерильную посуду и как можно скорее транспортируют в лабораторию.
  2. 2. Для выделения микроорганизмов подготавливают необходимое количество флаконов для культивирования объемом 50 мл и/или чашек Петри диаметром 90 мм.Следует учитывать, что в силу высокого уровня пространственной микрогетерогенностидонных местообитаний увеличение объема высеваемого грунта позволит охватить больше имеющихся в данном экотопемикрониш, вследствие чего увеличить фракцию видов, обнаруживаемых этим методом (в случае, если задача исследования подразумевает наиболее полный охват состава данного сообщества).

Для проведения экспериментов используется культура бактерий в стационарной фазе роста.

- Перед началом эксперимента определяется исходная плотность культуры с использованием спектрофотометра.

-   Экспериментальное воздействие осуществляется в соответствии с конкретными характеристиками тестируемого вещества.

- Оценка результатов воздействия производится путем высева тестируемой культуры на чашки Петри с агаризованной средой LB.    Чашки инкубируют в течение суток при температуре 37°С и   затем подсчитывают  количество сформировавшихся колоний (в опыте и контроле)

  1. 1. Клетки парамеций, содержащие инфекционные частицы бактерий, концентрируют до объема 1-1.5 мл в пробирке «эппендорф»
  2. 2. К полученному объему клеток добавляют детергент NonidetNP40 концентрации 1% из расчета: 1 мл клеток - 100 мкл 1% детергента; интенсивно взбалтывают
  3. 3. Содержимое лопнувших клеток вместе с инфекционными частицами бактерий осаждают центрифугированием (6000 об/мин х 5 мин)
  4. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость и промывают осадок от детергента. Для этого к осадку добавляют 1-1.5 мл дистиллированной воды, ресуспендируют осадок и повторяют центрифугирование по п.3. Процедуру отмывки повторяют еще раз.
  5. 5. К промытому осадку добавляют определенный объем дистиллята (в зависимости от предполагаемого количества инфекционных частиц), ресуспендируют осадок
  6. 6. В полученном гомогенате определяют концентрацию инфекционных частиц с помощью камеры Горяева:

Для изучения микроорганизмов используются, преимущественно, прижизненные методики, которые предполагают использование прямых и инвертированных световых микроскопов, снабженных различными системами для усиления оптического контраста. В общем случае, при изучении объектов при помощи светового микроскопа, пучок света от осветителя, фокусируемый при помощи конденсора, проходит через объект, после чего изображение формируется объективом и дополнительно увеличивается окуляром, черезкоторый изображение проецируется на сетчатку глаза или матрицу цифровой камеры. При изучении клеток непосредственно в культуре используют инвертированные микроскопы, в которых источник света располагается над объектом, а объектив – под ним, что позволяет рассматривать содержимоекультуральных сосудов сквозь их дно. Это позволяет изучать минимально потревоженные клетки в естественной для них среде. Однако разрешение при таких исследованиях остается не очень высоким, поскольку максимальное увеличение используемых объективов составляет 40-63.

Фиксирующая смесь: 1 вариант: 4 % глутаральдегид и 1 % OsO4 на 0.1 М какодилатном(или фосфатном) буфере (рН 7.4 или 7.2). Фиксацию проводят на тающем льду в темноте в течение 1 часа, с полной заменой фиксатора через 30 мин после начала фиксации. 2 вариант: 4 % глутаральдегид  на 0.1 М какодилатном (или фосфатном) буфере (рН 7.4 или 7.2) 3 вариант. Клетки префиксируют в парах OsOв течение 10-15 мин., затем фиксируют 4% глутаральдегидом.