Методика подготовки библиотек ДНК для секвенирования на Illumina HiSeq 2500 набором Nextera DNA Library Preparation Kit

Подробная методика подготовки библиотек ДНК набором Nextera DNA Library Preparation Kit: http://www.liai.org/files/nextera_dna_sample_prep_guide_15027987_b.pdf

1. 1. Реагенты и оборудование, необходимые для подготовки библиотек Nextera DNA

• Флуориметр Quantus, набор для количественного определения двухцепочечной ДНК QuantiFluor® dsDNA System и 0.5 ПЦР-пробирки (2 шт на образец).
• Спектрофотометре Implen NanoPhotometer, безворсовые салфетки.
• Прибор для ПЦР с нагревающейся крышкой.
• Микроцентрифуга.
• Вортекс.
• Набор для подготовки библиотек Nextera DNA Sample Preparation Kit.
  • Упаковка 1 из 1:
    • TDE1 (Tagment DNA Enzyme).
    • TD (Tagment DNA Buffer).
    • NPM (Nextera PCR Master Mix).
    • PPC (PCR Primer Cocktail).
    • RSB (Resuspension Buffer).
  • Набор индексов Nextera Index Kit и сменные крышки.
  • Магнитные частицы AMPure XP Beads.

• Магнитный штатив.
• Пипетки на 10 мкл, 20 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 1000 мкл (два набора для работы в пре- и пост-ПЦР зонах).
• Насадки с фильтрами на 10 мкл (6 шт.), 200 мкл (14 шт.), 1000 мкл (5 шт.).
• 2 мл ПЦР-пробирки (2 шт.).
• 5 мл пробирки (1 шт.).
• 5 мл пробирки (5 шт.).
• Если библиотеки готовятся для более, чем 24 образцов, в протоколе используются планшеты TCY вместо пробирок (3 шт.) и планшеты MIDI (1 шт.).
• Стрип на 12 лунок (1 шт.).
• Этиловый спирт (95-100%).
• 70% этиловый спирт или эквивалентное средство для стерилизации поверхностей.
• Контейнеры со льдом.
• Набор для очищения ДНК после тагментации.
  • MinElute PB буфер.
  • MinElute PE буфер.
  • MinElute колонки (1 шт.).

2. 2. Измерение концентрации ДНК на флуориметре Quantus

2.1. Реагенты и оборудование: 

• 0.5 ПЦР-пробирки (1 шт. на образец);
• 20Х ТЕ буфер;
• краситель dsDNA QuantiFluor^®;
• микроцентрифуга;
• вортекс.

2.2. Процесс

• Подготовить 1х ТЕ буфер.

• Подготовить рабочий раствор в соотношении 1:400, смешав краситель QuantiFluor® dsDNA Dye и 1Х TE буфер.

• Перемешать пробирки на вортексе в течение 2-3 с.
• Инкубировать пробирки минимум 2 мин. при комнатной температуре и проводить измерения в течение 1 ч. для минимизации воздействия света на реагенты.
• Выбрать нужный протокол, объем анализируемого образца и единицы концентрации на дисплее прибора.
• Поставить образец в прибор и закрыть крышку, концентрация образца будет показана на дисплее.

3. 
   3. Измерение качества ДНК на спектрофотометре Implen NanoPhotometer P360

   3.1. Реагенты и оборудование:

• безворсовые салфетки;
• микроцентрифуга;
• вортекс.

  3.2. Процесс:

• Вставить субмикролитровую ячейку NanoPhotometer P-Class в держатель логотипом вперед.
• На дисплее прибора выбрать режим "Нанообъем".
• Для режима "Нанообъем" выбрать фактор крышки (10, 50 или 250 в зависимости от предполагаемой концентрации образца – для низких, средних и высоких концентраций соответственно).
• Выбрать режим "Нуклеиновые кислоты", далее – "дцДНК".
• Нанести референсный образец в центр измерительного окна и нажать кнопку "Blank".
• Пипетировать необходимый объем анализируемого образца.
• Удалить остатки образца из окна измерения и с зеркала в крышке слегка влажной безворсовой салфеткой, смоченной в воде, 70% этаноле или изопропаноле.
• Для распечатки результатов измерений нажать "Print".
• Соотношение 260/280 (содержание протеинов) должно быть между 1.75 и 2.05.

• Выделенные ДНК могут храниться при +2-+8°С в течение 2 недель. Для долговременного хранения, ДНК следует держать при -80 - -20°С.

4. 4. Подготовка библиотек:

• заполнить рабочий лист для Nextera Library Prep;
• распечатать лист для того, чтобы сверить разведение ДНК перед подготовкой библиотек.

Перед началом подготовки библиотеки, развести образец до 2.5 нг/мкл в 20 мкл;

• перемешать пипеткой 10 раз каждый образец перед взятием для разведения. Это ОЧЕНЬ ВАЖНО, так как точная концентрация важна для подготовки данной библиотеки и генерации кластеров перед секвенированием.

4.1. Тагментация ДНК

4.1.1. Реагенты и оборудование:

• TDE1 (Tagment DNA Enzyme);
• TD (Tagment DNA Buffer);
• прибор для ПЦР с нагревающейся крышкой;
• микроцентрифуга;
• пипетки на 10 мкл, 20 мкл, 100 мкл;
• насадки с фильтрами на 10 мкл (1 шт.), 200 мкл (1 шт.);
• 2 мл ПЦР-пробирки (1 шт.) или планшет TCY (1 шт.).

4.1.2. Процесс

• В пробирки с 20 мкл образца, помеченные как NET1, добавить 25 мкл буфера TD.
• Добавить 5 мкл энзима TDЕ1.

• Перемешать пипеткой содержимое пробирок 5 раз.
• Центрифугировать пробирки при 800-1200 rpm 1 мин.
• Поставить пробирки в термоциклер: 55°С на 5 минут. Держать при 10°С.

4.2. Чистка тагментированной ДНК

Тагментированная ДНК очищается от транспозомов  Nextera. Этот шаг важен, так как транспозомы Nextera могут связываться с ДНК и препятствовать нормальному течению последующих реакций.

4.2.1. Реагенты и оборудование:

• MinElute PB буфер;
• MinElute PE буфер;
• MinElute колонки (1 шт.);
• RSB (Resuspension Buffer);
• вортекс;
• микроцентрифуга;
• пипетки на 100 мкл, 1000 мкл;
• насадки с фильтрами на 200 мкл (2 шт.), 1000 мкл (3 шт.);
• 5 мл пробирки (2 шт.).

4.2.2. Процесс

• Перенести 50 мкл образца в пробирку, помеченную как NSP2.
• Добавить 250 мкл РВ буфера.
• Перемешать пипеткой 10 раз.
• Перенести содержимое пробирки в колонку.
• Центрифугировать при 1300 g 1 мин., вылить жидкость.
• Добавить 750 мкл промывочного буфера РЕ.
• Центрифугировать при 1300 g 1 мин., вылить жидкость.
• Центрифугировать еще раз при 1300 g 1 мин.
• Поместить колонку в новую пробирку, помеченную как NSP.
• Добавить 32.5 мкл RSB буфера в центр колонки.
• Инкубировать 2 мин. при комнатной температуре.
• Центрифугировать при 1300 g 1 мин.

4.3. Амплификация тагментированной ДНК

4.3.1. Реагенты и оборудование

• Прибор для ПЦР с нагревающейся крышкой
• Микроцентрифуга
• Вортекс
• NPM (Nextera PCR Master Mix)
• PPC (PCR Primer Cocktail)
• Набор индексов
• Пипетки на 10 мкл, 20 мкл
• Насадки с фильтрами на 10 мкл (3 шт), 200 мкл (2 шт)
• 2 мл ПЦР-пробирки (1 шт) или планшет TCY (1 шт)

4.3.2. Процесс

Необходимо поддерживать цветовой баланс секвенируемых баз. Для этого см. инструкцию по пулингу.

• Одни и те же пары индексов не следует использовать в следующих реакциях для избегания контаминации
• Перевернуть пробирки 3-5 раз для перемешивания и быстро процентрифугировать
• Добавить 5 мкл праймеров с индексами 2 (с оранжевыми крышками) в пробирки NAP1
• Добавить 5 мкл праймеров с индексами 1 (с белыми крышками) в пробирки
• Добавить 15 мкл NPM в пробирки
• Добавить 5 мкл PPC в пробирки
• Добавить 20 мкл очищенной ДНК из пробирки NSP3 в NAP1
• Перемешать содержимое пробирок пипеткой 3 - 5 раз
• Центрифугировать при 280 g 1 минуту
• Инкубировать в термоциклере по программе:
• 72°С 3 мин
• 98°С 30 сек
• 5 циклов:
  • 98°С 10 сек
  • 63°С 30 сек
  • 72°С 3 мин
• Держать при 10°С

4.4. Чистка продуктов ПЦР

4.4.1. Реагенты и оборудование:

• микроцентрифуга;
• вортекс;
• магнитный штатив;
• этиловый спирт (95-100%);
• магнитные частицы AMPure XP Beads;
• RSB (Resuspension Buffer);
• пипетки на 50 мкл, 200 мкл, 1000 мкл;
• насадки с фильтрами на 200 мкл (7 шт.), 1000 мкл (2 шт.);
• 5 мл пробирки (3 шт.) или планшет TCY (1 шт.) и MIDI (1 шт.).

4.4.2. Процесс

• Приготовить 80% этанол (400 мкл на образец).

• Центрифугировать пробирки 30 с. при 800-1200 рпм, чтобы осадить конденсат.
• Перенести 50 мкл ПЦР продуктов в пробирку, помеченную как NAP2.
• Перемешать AMPure XP частицы на вортексе в течение 30 с.
• Добавить 30 мкл AMPure XP частиц в образцы. Перемешать пипеткой 10 раз.

• Инкубировать 5 мин. при комнатной температуре.
• Поставить на магнит на 2 мин.
• Осторожно удалить пипеткой жидкость.
• Добавить 200 мкл свежего 80% этанола в каждую пробирку, инкубировать 30 с., осторожно удалить жидкость.
• Провести вторую промывку. Добавьте 200 мкл свежего 80% этанола в каждую пробирку, инкубировать 30 с., осторожно удалить жидкость до последней капли.
• Просушить на воздухе в течение 15 мин.
• Добавить 32.5 мкл RSB.
• Снять с магнита и перемешать пипеткой 10 раз.
• Инкубировать 2 мин.
• Поставить на магнит и ждать 2 мин.
• Перенести 30 мкл раствора из пробирки NAP2 в NLP.

5. 5. Проверка концентрации библиотеки на Quantus

Проводить измерения на приборе, как было описано выше.

6. 6. Проверка качества библиотеки на гелевом электрофорезе QIAxcel

Для детекции, концентрация библиотеки должна быть как минимум 0,4 нг/мкл.

Минимальный объем образца должен составлять 5 мкл. До необходимого объема образцы ДНК можно доводить QX Dilution Buffer.

   6.1. Реагенты и оборудование:

• гелевый ДНК картридж;
• выравнивающий маркер для ДНК –
  • его следует менять каждые 50 запусков или 3 дня. Для приготовления нового маркера следует залить 15 мкл выравнивающего маркера в каждую лунку стрипа и добавить по капле минерального масла также во все 12 лунок стрипа;
• размерный маркер для ДНК –
  • размерный маркер не обязательно добавлять в каждый запуск, можно через 8. Однако, в этом случае картридж и метод анализа должны быть одинаковыми для всех запусков;
• разбавочный буфер.

В случае замены картриджа, необходимы следующие реагенты:

• промывочный буфер;
• разделительный буфер;
• маркер калибровки интенсивности;
• пипетки на 10 мкл, 50 мкл;
• насадки с фильтрами на 10 мкл (2 шт.), 200 мкл (2 шт.);
• Стрипы из 12 пробирок.

  6.2. Перед тем, как начать

• Выбрать размерный маркер, близкий по размерам к анализируемым образцам – размер интересующих фрагментов должен быть меньше максимального пика размерного маркера. Также размерный маркер должен соответствовать выравнивающему маркеру, используемому при анализе. Смотри стр. 20 QIAxcel DNA Handbook с таблицей соответствия маркеров.
• Развести размерный маркер с начальной концентрации 100 нг/мкл до 5 или 10 нг/мкл также в разбавочном буфере.

  6.3. Подготовка прибора и запуск анализа

• В программе QIAxcel ScreenGel выбрать режим "ДНК".
• Поставить картридж в прибор и вставить смарт-ключ в специальный разъем.
• Установить выравнивающий маркер в лоток MARKER.
• Загрузить образцы.
• Выбрать профиль процесса (набор для анализа, метод – подробное описание смотри на стр. 38 – 40 QIAxcel DNA Handbook для набора High Resolution Kit), ввести информацию об образцах.

 Краткое описание методов:

Методы OL – для образцов с низкой концентрацией <10 нг/мкл.

Метод OM – для образцов со средней концентрацией 10-100 нг/мкл.

Метод OH – для образцов с высокой концентрацией >100 нг/мкл.

• В программе выбрать размерный маркер, если он используется, и выравнивающий маркер.
• Для запуска анализа нажать "Run".

6.4. После работы

• Если картридж не используется ежедневно, заклеить отверстие на обратной стороне картриджа клейким колпачком, вложить картридж в блистерную упаковку, вставить носики в гель и убрать в холодильник. Убрать в холодильник выравнивающий маркер в стрипе. Если картридж будет использоваться в течение дня или на следующий день, его можно хранить в приборе в позиции "Park".