Оптическая микроскопия как никакой другой метод смогла продемонстрировать для биологии взаимосвязь доступных методов исследования и получаемых научных результатов. Возможность исследовать биологический объект прижизненно, непосредственно наблюдать происходящие процессы оставляет этот метод методом выбора во многих исследованиях. В ресурсном центре представлена современная микроскопическая техника включая конфокальную и двухфотонную микроскопию, методы сверхразрешения, специальные оптические методы такие, как детекция отдельных флуоресцентных молекул, определение концентрации исследуемых веществ в живых клетках, определение скорости диффузии биогенных молекул и т.д. Важной составляющей является наличие всего необходимого оборудования для работы с живыми клетками включая микроманипуляцию, массовое исследование и сортировку клеток на проточном сортирующем цитофлуориметре. Помимо оптического оборудования оборудования, в центре установлено современное программное обеспечение для морфометрии и обработки полученных изображений.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
Мультифотонная конфокальная микроскопия
Количественная флуоресцентная микроскопия
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
Используемое оборудование РЦ:
сканирующие конфокальные микроскопы Leica SP5 и Leica SP5 MP.
Описание
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) является одним из методов, получать оптические срезы препарата. Истинное конфокальное сканирование (TCS) представляет собой метод, в котором на объекте единовременно засвечивается только одна точка, ограниченная дифракционным пределом. Преимуществом конфокальной микроскопии является увеличение контраста путем удаления внефокусного света. Z-серии изображений могут быть использованы для трехмерной визуализации и реконструкции исследуемых объектов. Конфокальный микроскоп Leica SP5 на базе инвертированного микроскопа Leica DMI-6000 позволяет визуализировать пространственную структуру живого и фиксированного материала на глубину до 200 мкм, однако для глубины более 80-100 мкм рекомендуется использовать метод двухфотонной микроскопии. Метод конфокальной микроскопии может быть использован для исследования клеток и тканей в живом состоянии, получения данных о распределении меченных флуоресцентными зондами веществ в нескольких измерениях (x,y,z, время, длина волны испускания), а так же специальных методов, включая FLIM, FRAP, FLIP, и FCS.
Доступные лазеры для возбуждения флорохромов:
- Аргоновый лазер 458, 476, 488, 496, 514 нм.
- Гелий-неоновые лазеры 543 и 633 нм.
- Диодный лазер 405 нм (только на SP5).
- Мультифотонный лазер 690-1040 нм (только на SP5 MP).
- Белый лазер 470-670 нм (только на SP5 MP).
Диапазон детекции флуоресценции – 400-800 нм.
Скорость сканирования линии – от 1 Гц до 16 кГц.
Максимальный размер кадра – 8192x8192 точек.
Источник:
Мультифотонная конфокальная микроскопия
Используемое оборудование РЦ:
сканирующий конфокальный микроскоп Leica SP5 MP с лазером SpectraPhysics MaiTai HP (14 W Millennia + Tsunami).
Описание
Суть микроскопии с использованием мультифотонного возбуждения состоит в создании в диффракционно ограниченной точке на образце достаточной плотности фотонов для получения феномена двухфотонного возбуждения. При этом, энергия фотонов, поглощённых флуорохромом в течение короткого (1·10-15 c) времени складывается, что даёт возможность антистоксовской флуоресценции. Поскольку для того, чтобы флуорохром перешёл в возбуждённое состояние, необходимо поглощение двух фотонов, вероятность испускания флуорохромом вторичного фотона пропорциональна квадрату интенсивности возбуждения. Флуоресценция будет сильнее в случае, когда луч лазера четко сфокусирован, а не рассеян. Максимальная флуоресценция наблюдается в фокальном объёме, в результате чего уменьшает количество внефокусного света. С помощью метода мультифотонной микроскопии можно снимать объекты на глубину до 200 мкм. Для мультифотонной микроскопии используется импульсный инфракрасный лазер с длиной волны от 690 нм до 1040 нм. Преимуществами мультифотонной микроскопии можно назвать: использование инфракрасного диапазона для возбуждения, что уменьшает рассеяние и позволяет исследовать более толстые биологические объекты; возбуждение строго ограниченной области, что предотвращает выцветание флуорохрома выше и ниже этого места; меньшую фототоксичность; возможность регистрировать весь свет от препарата, а не только свет прошедший через конфокальную диафрагму, что даёт возможность собирать больше света, используя недесканируемые детекторы.
Источник:
Лазерная микродиссекция
Используемое оборудование РЦ:
прямой микроскоп с оборудованием для лазерной микродиссекции материала Leica LMD7000.
Описание
Лазерный микродиссекция является бесконтактным способом выделения отдельных клеток или целых областей ткани образцов. Толщина, текстуры и подготовка методика исходной ткани относительно не важны. Дисектировнный материал затем можно использовать для дальнейших молекулярно-биологических методов, таких как ПЦР, ПЦР в реальном времени, протеомики и других аналитических методов. Метод применяется для сверхчистой микродиссекции и сбора диссектированного материала, выделения отдельных адгезированных живых клеток, лазерной аблации нежелательных адгезированных клеток,индукции контролируемого повреждения ДНК для изучения механизмов репарации.
Диссекция производится твердотельным лазером с диодной накачкой.
- Максимальная энергия импульса – 120 мкДж.
- Частота импульсации – 10-5000 Гц.
- Длина волны – 349 нм.
Перемещение лазерного луча осуществляется оптикой микроскопа при неподвижном объекте для небольших объектов и оптикой совместно со столиком для протяжённых объектов
Толщина линии резки контролируется регулируемой апертурой лазера.
В качестве носителя материала для диссекции используются:
- стандартные стекла с покрытием PPS или PEN,
- стекла двойной ширины с покрытием,
- мембраны в держателе (PET, POL, PPS, FLUO),
- чашки Петри 50 мм с мембранной вставкой.
Для сбора материала используются:
- 96-луночные планшеты,
- микроцентрифужные пробирки.
Площадь, вырезаемая за один шаг без дополнительных разрезов, – до 2 мм2.
Сбор вырезанного материала производится с исключением контаминации и загрязнений без дополнительных импульсов за счёт силы тяжести.
Возможно проведение диссекции в режимах флуоресценции и дифференциально-интерференционного контраста.
Источник:
Количественная флуоресцентная микроскопия
Используемое оборудование РЦ
Комплекс реализации коррелированного по времени посчёта одиночных фотонов (TCSPC) Leica SMD FLICS на сканирующем конфокальном микроскопе Leica SP5 MP.
Описание
Количественные методы флуоресцентной мироскопии:
- Визуализация времени затухания флуоресценции (FLIM) за счёт использования импульсных источников света, таких как белый лазер и мультифотонный лазер, и детекторов PicoQuant, позволяющих регистрировать время жизни флуоресценции. Таким образом, FLIM является методом визуализации флуоресценции, где контраст основан на времени жизни флуорохромов, а не на их спектрах излучения. Время флуоресценции определяется как среднее время, в течение которого молекула остается в возбужденном состоянии до испускания фотона.
- Измерение анизотропии флуоресценции.
- Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) и флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопи (FCCS) для получения количественной информации, такой как: коэффициенты диффузии, гидродинамические радиусы, средние концентрации, кинетические показатели химической реакци, динамика синглет-триплетных состояний флуорохрома.
- Флуоресцентная корреляционная спектроскопия времени затухания флуоресценции (FLCS).
- Детекция одиночных молекул флуорохромов (SMD).
- Анализ гистограммы счета фотонов (PCH).
- Возможно проведение количественных экспериментов с использованием эффекта форестеровской резонансной передачи энергии (FRET). FRET представляет собой процесс, в котором энергия возбужденного флуорохрома (донор) без излучения передается на второй, невозбужденный флуорохром (акцептор), находящийся в непосредственной близости. FRET используется в качестве молекулярной линейки из-за его чувствительности в диапазоне 2-10 нм. Передача энергии приводит к изменениям в интенсивности флуоресценции двух флуорохромов.
Источник:
