Описание жидкостного хромато-масс-спектрометра Agilent 6538 UHD.
Прибор может быть использован для:
- • решения сложных аналитических задач биохимии,
- • метаболомики,
- • протеомики:
- • изучения микрокомпонентов биосред и сложных матриц неизвестного состава;
- • установления структуры неизвестных веществ.
Размещение: Василеостровская площадка.
Статус: эксплуатация в рабочем режиме.
Основные технические характеристики
Тип прибора – гибридный квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр, обеспечивающий два этапа масс-фрагментации.Масс-детектор определяет молекулярную массу исследуемого иона до 15 000 а.е.м.
Диапазон масс – 20-15 000 а.е.м.
Точность МС определения массы 0.5 ppm RMS c калибровкой по внутреннему стандарту, измерение для протонированного молекулярного иона резерпина (609.2807 m/z) при скорости потока элюента 400 мкл/мин.
Точность МС/МС определения массы 1 ppm RMS, измерение для перехода от протонированного молекулярного иона резерпина (609.2807 m/z) к наиболее интенсивному дочернему иону (397 m/z) при скорости потока элюента 400 мкл/мин.
Точность МС определения массы для прямого введения на чип в режиме нанопоточной ВЭЖХ-на-чипе 2 ppm RMS c калибровкой по внутреннему стандарту, измерение для дипротонированного молекулярного иона 3 фмоль Glu-Fib пептида (785 m/z).
Точность МС/МС определения массы для прямого введения на чип в режиме нанопоточной ВЭЖХ-на-чипе 5 ppm RMS, измерение для перехода от дипротонированного молекулярного иона 3 фмоль Glu-Fib пептида (785 m/z) к самому интенсивному дочернему иону (685 m/z).
Разрешение: 50 000 измерение для величины m/z 2 722, более 25 000 для m/z 118.
Чувствительность МС в режиме нанопоточной ВЭЖХ-на-чипе 200 аттомоль для пептидов (дайджест бычьего сывороточного альбумина) при потоке элюента 300 нл/мин.
Чувствительность МС/МС для прямого введения на чип в режиме нанопоточной ВЭЖХ-на-чипе 300 аттомоль для Glu-Fib пептида при потоке элюента 300 нл/мин дают соотношение сигнал:шум 80:1 по самому интенсивному фрагменту.
Чувствительность МС при ионизации в электроспрее ввод 5 пг резерпина при потоке элюента 400 мкл/мин дает отношение сигнал / шум не хуже 80:1 для протонированного молекулярного иона с m/z 609 а.е.м.
Чувствительность МС/МС при ионизации в электроспрее Ввод 5 пг резерпина при потоке элюента 400 мкл/мин должен давать отношение сигнал / шум не хуже 200:1 для перехода от изолированного протонированного молекулярного иона с m/z 609 к четырем дочерним ионам (174, 195, 397, 448 m/z).
Скорость сканирования в МС-режиме – 20 спектров/с.
Линейный динамический диапазон – 5 порядков.
Скорость сканирования в режиме МС/МС 1 спектр МС и 10 спектров МС/МС в секунду.
Чувствительность определения пептидов 200 аттомоль для пептидов (дайджест бычьего сывороточного альбумина) при потоке элюента 300 нл/мин.
Возможна регистрация хроматограмм в двумерном режиме (2D хроматография).
ВЭЖХ система обеспечивает возможность препаративного выделения фракций и нанесение их на микропланшеты.
Хроматографическая система обладает минимальным мертвым объемом 180 мкл для обеспечения чувствительности 200 аттомоль для пептидов и исключения размывания хроматографических пиков.
Насос нанопоточный, обеспечивающий подачу подвижной фазы в колонки диаметром менее 100 мкм.
Двухпоршневая конструкция с последовательным включением камер насоса.
Активный выходной клапан в наличии.
Наличие электронного контроля потока.
Задаваемая величина потока – от 10 нл/мин до 4 мкл/мин.
Точность задания градиента – 0.2 %, при потоке 500 нл/мин.
Точность установки потока – 0.4 % СКО, при потоке 600 нл/мин.
Мертвый объем – 180 мкл.
Вспомогательный градиентный насос на два растворителя для расширения возможностей анализа на стандартных хроматографических колонках.
Задаваемая величина потока – от 0.1 мкл/мин до 5.0 мл/мин.
Диапазон давления – от 20-400 атм.
Погрешность при формировании потока – 0.07% СКО.
Погрешность при формировании градиента – 0.2%.
Материал плунжеров насоса Сапфир.
Микроплашечный автосэмплер с термостатом Две стандартные 96-ти или 384-х луночных плашки.
Отбираемый объем 0.01 – 40 мкл.
Максимальное рабочее давление – 400 бар.
Погрешность величины объема отобранной пробы 0.5% СКО в диапазоне 5-40 мкл.
Точность дозирования – 1%.
Скорость ввода образца – 30 с для 0.1 мкл.
Возможность термостатирования образцов для предотвращения испарения и термического разложения биологических образцов от +4оС до +400оС.
Микровакуумный дегазатор.
Количество каналов дегазации – 4 канала.
Максимальный поток – 5 мл/мин на канал.
Внутренний объем одного канала – 1 мл.
Допустимый диапазон рН элюента – 1-14 единиц рН.
Микроколлектор фракций – система для сбора фракций на планшеты различного формата, совместимые с системами MALDI различных производителей.
Максимальный поток – 100 мкл/мин.
Сбор фракций – от 100 до 5000 нл.
Величина задержки отбора фракций – 37 мкл.
Сбор пробы – стандартные 2 мл виалы (100 шт.) или стандартные виалы на 6 мл (3х15 шт.).
Сбор пробы в стандартные 2 мл виалы (100 шт.) и стандартные виалы на 6 мл (3х15 шт.).
Максимальный объем пробы – 20 мкл.
Максимальный мертвый объем – 0.25 мкл.
Возможность охлаждения фракций для предотвращения испарения и термического разложения биологических образцов – от +4оС до +40оС.
Возможность работы в режиме сбора фракций по времени и по сигналу спектрофотометрического или масс-селективного детектора (с возможностью задания границ пика).
Интерфейс для реализации нанопотоковой хроматографии, предусматривающей использование интегрированных в чип капиллярных устройств.
Механизм загрузки и позиционирования хроматографической интегрированной наноколонки.
Наличие микропереключателя потоков (микро-крана) для реализации 2D-хроматографии.
Наличие нанопоточного источника ионизации, позволяющего помещать стандартные элементы нанопоточной хроматографической системы (капилляры, колонку, распылитель).
Видеокамера для визуализации процесса распыления и позиционирования ионного источника относительно входа в масс-спектрометр.
Спектрофотометрический мультиволновой детектор – от 190 до 950 нм.
Точность задания (шаг) – 1 нм.
Возможность регистрации спектров в диапазоне от 190 до 950 нм обеспечена наличием двух источников излучения в различных спектральных диапазонах – дейтериевая и вольфрамовая лампы.
Оптическая схема детектора должна включать диодную матрицу включает диодную матрицу с количеством 1024 светодиода.
Скорость регистрации спектра по диапазону 190-950 нм – 12.5 миллисекунд.
Детектор должен иметь возможность одновременной регистрации сигнала на нескольких длинах волн на восьми различных длинах волн
Время регистрации сигнала – от 0.1 до 20 с.
Диапазон корректировки фона от 2 до 400 нм.
Точность задания (шаг) корректировки – 1 нм.
Уровень шума на длинах волн – 254 нм и 750 нм, ширина полосы – 4 нм ±0.8x10-5 единиц адсорбции.
Дрейф базовой линии в процессе прогрева системы – 2.00x10-3 единиц адсорбции в час.
Линейность сигнала – 2.5 единицы адсорбции.
Точность измерения длин волн с возможностью автокалибровки – 1 нм.
Контроль линейности измерения концентраций в диапазоне, контроль по кофеину, 265 нм 2 единицы адсорбции.
Автоматическое задание спектральной ширины щели – от 1 нм до 16 нм.
Возможность выбора проточных кювет 8 типов: стандартная – 13 мкл, полумикроячейка – 5 мкл, микроячейка – 2 мкл, полунаноячейка – 500 нл, наноячейка – 80 нл, препаративные ячейки трех типов.
Возможность программирования длины волны и интервалов, полярность, ширины пика, автобалансировка ламп, порога чувствительности, режима сохранения данных.
Проточная кювета – 80 нл.
Включает аналитические наноколонки 300SB-C18 для анализа белков и предколонки к ним, внутренний диаметр 0.075 мм и 0.3 мм для реализации 2D хроматографии, комплект капилляров и фитингов из биосовместимого полимера для подключения.
Режим сканирования по родительским и по дочерним ионам, режим сканирования по потерям / присоединениям нейтральных частиц.
Программное обеспечение – Spectrum Mill, предназначенное для проведения поиска и идентификации белков и пептидов с развитыми функциональными возможностями: де-ново сиквенс, количественный анализ, валидация результатов, поиск по общедоступным базам данных.
Возможность идентификации мутаций, пост-трансляционных и химических модификаций.
Программное обеспечение, предназначенное для проведения поиска и идентификации метаболитов лекарственных веществ.
Программное обеспечение Metabolite ID, предназначенное для проведения поиска и идентификации метаболитов лекарственных веществ с предсказанием структур всех возможных метаболитов соединения и их целевым поиском с подтверждением правильности идентификации МС/МС фрагментацией.
Принцип работы
Жидкостный хромато-масс-спектрометр
QTOF-масс-спектрометр предназначен для высокоточного определения масс исходных или дочерних ионов при МС- или МС/МС-анализе, соответственно. Мягкие условия ионизации электроспреем позволяют работать с термолабильными соединениями, такими как, белки/пептиды и нуклеиновые кислоты (соединения с молекулярными весами более 3 кДа могут быть анализированы за счет формирования многозарядных ионов). Подключение к ВЭЖХ-системе создает возможности для эффективного анализа многокомпонентных смесей.
Наиболее частые приложения:
- - идентификация целевых веществ и их характеристика в смесях разной степени сложности (в том числе, fingerprint-анализ, анализ модификаций и пр.);
- - скрининговый анализ клеточных лизатов и экстрактов;
- - оценка наличия примесей в синтетических препаратах;
- - метаболомные исследования.
Масс-спектрометр комбинированного типа оснащен квадрупольным фильтром масс (разрешает селекцию материнский ион с заданным m/z для МС/МС-анализа), гексапольной ячейкой столкновения (где под действием переменного электромагнитного поля происходит столкновение ионов друг с другом и с молекулами азота и их распад) и времяпролетным (TOF)-анализатором масс с системой электронных зеркал. Перед входом в фильтр масс и в TOF-анализатор имеются октопольные проводники ионов, обеспечивающие концентрацию ионного пучка. Высокая частота (до 4 ГГц) и чувствительность детектора дают возможность получения данных в МС- и МС/МС/МС-режимах в ходе одного анализа. Кроме того, в ходе одного анализа возможна детекция положительных и отрицательных ионов за счет переключения полярности ионизатора, проводящей системы и TOF-анализатора.
Измерение величины m/z с точностью: 1 ppm в режиме МС; 3 ppm в режиме МС/МС. Улучшенное разрешение прибора определяется наличием системы электронных линз на пути ионов до входа в TOF-анализатор, которые обеспечивают фокусировку ионного пучка, а также его уплощение для единовременного старта. Высокая воспроизводимость определения m/z обеспечивается за счет постоянной подачи стандартов в ходе анализа, по массам которых идет корректировка выдаваемых анализатором результатов.
Чувствительность при детекции сигнала – фемтомоли вещества (10-15 М). Детекцию ионов – фотоумножитель. Ионы, преодолевшие путь в трубе анализатора, попадают на многоканальную пластинку (multichannel plate), пронизанную микропорами, и выбивают с ее поверхности электроны. Эти электроны, ударяясь о стенки микропор, вызывают амплификацию сигнала (за счет увеличения числа вышедших электронов), что обеспечивает высокую чувствительность прибора. Электроны попадают на сцинтиллятор, свет которого через линзу фокусируется на фотоумножитель, генерирующий электрический сигнал системе.
Диапазон детектируемых m/z в МС- и МС/МС-режимах – 100-3200 а.е.м. Частота получения MC- и МС/МС-спектров 25 и 20 спектров/с, соответственно. Могут собираться данные по положительным и отрицательным ионам в ходе одного анализа. TOF-анализатор может работать в двух режимах - 2 и 4 ГГц: в первом случае выигрывает чувствительность, во втором – разрешение.
Ионизатор представлен либо (1) двойным электроспреем (Dual ESI) для ручного нанесения образца или же введения материала, поступающего с капиллярной / аналитической ЖХ-колонки; либо (2) камерой наночипа (ChipCube), позволяющей вводить материал, элюируемый с наноколонки в чипе. В камерах обоих типов электроспрей ориентирван перпендикулярно отводящему капилляру, что увеличивает эффективность удаления растворителя.
ЖХ-система включает:
- бинарные нанопоточный (1-200 мкл/мин) и микропоточный насосы (последний может создавать как микро-, так и аналитический поток в диапазоне 200-2000 мкл/мин);
- вакуумный дегазатор: позволяет дегазировать 4 раствора параллельно;
- термостатируемый автосамплер: поддерживает постоянную температуру 60оС; работает с 3 вариантами подставок под флаконы различного объема (1.8 мл и 6 мл); возможно варьирование объема и скорости забора образца, а также положения иглы при заборе пробы;
- ультрафиолетовый детектор: скорость сбора данных 80 Гц, параллельный сбор данных по 8 длинам волн, программируемая оптимизация чувствительности за счет изменения размера щели;
- микроколлектор фракций: позволяет автоматический сбор фракций в виалы, планшеты, а также на плстины для MALDI.
Принцип работы. Формирование ионов аналитов в большинстве случаев происходит в растворе до процесса распыления; аналиты, не дающие ионов в растворе также могут быть проанализированы - сильный электрический заряд, формирующийся на поверхности распыляемых капель, может обеспечивать процесс их ионизации в ходе распыления.
Раствор аналитов, поступающий в камеру распыления через иглу, подвергается действию (1) сильного напряжения (2-6 кВт, между иглой и скиммером, полярность создаваемого электрического поля может меняться, отбирая ионы нужного знака) и (2) потока нагретого газа (азота), что в совокупности приводит к распылению раствора аналита на отдельные капли. Объем капель уменьшается за счет потока газа и высокой температуры камеры, в результате, одноименно заряженные частицы разлетаются с их поверхности под действием кулоновских сил. Освободившиеся ионы поступают через капилляр в анализатор. Поскольку сам раствор не разогревается при распылении, не происходит термического разложения аналитов. Варьирование потока газа в ионизаторе позволяет варьировать потока ЖХ от 100 нл/мин до 1 мл/мин, т.е. разрешает использовать для анализа нанопотоковые чипы, капиллярные или аналитические колонки.
Процесс ионизации и распыления аналитов зависит от выбора подвижной фазы для ЖХ. На его эффективность влияют:
- - рН подвижной фазы (он должен способствовать формированию ионов желаемой полярности);
- - температура кипения подвижной фазы - чем она ниже, тем легче происходит формирование спрея;
- - поверхностное натяжения элюирующего раствора - чем оно меньше, тем быстрее освобождаются ионы с поверхности капель спрея.
Нежелательно использование для элюции солевых буферов, так как их компоненты будут загрязнять ионизатор.
В режиме работы квадруполя "full screen" проводят МС-анализ, так как. сквозь него проходят все образовавшиеся ионы – при этом радиочастотный потенциал не подается ни на квадруполь, ни на гексаполь ячейки столкновения. Если на электроды квадруполя подается переменное напряжение, то отбираются только ионы с заданным m/z, которые фрагментируются в ячейке столкновения. Пучек ионов (материнских или дочерних), выходящих из ловушки столкновения, уплотняется октополем и уплощается на слайсере перед входом в TOF-анализатор. Траектория движения ионов в TOF-анализаторе перпендикулярна таковой в проводящей системе прибора, поэтому ионы плоского пучка имеют общую стартовую позицию; они разгоняются ускоряющим напряжением, отражаются от системы электронных зеркал (рефлектрон) на вершине трубы и достигают детектора за время, обратнопропорциональное величине m/z.
