В ресурсном центре возможна реализация всех этапов подготовки материала для рутинных молекулярных исследований. Основной набор задач, который может быть решен на базе центра, сводится к определению нуклеотидной последовательности определенного участка генома изучаемого штамма. Это необходимо для: (1) проверки степени очистки культивируемого штамма; (2) идентификации культивируемого штамма с использованием молекулярных методов (в том числе, ДНК-штрихкодирования); (3) определения положения культивируемого штамма на молекулярном филогенетическом древе.

Эти задачи решаются при помощи амплификации определенного участка генома изучаемого организма методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей очисткой и, при необходимости, клонированием полученного продукта реакции (ампликона). Очищенный (клонированный) фрагмент ДНК передается пользователю и может быть использован для последующих процедур, в частности, чтения нуклеотидной последовательности методом Сэнгера.

Выделение тотальной ДНК из культуры гуанидиновым методом.

А. Состав и способ приготовления буфера.

Компоненты.

Гуанидинтиоцианат                                       5 г

Стерильная бидистиллированная вода           5 мл

1M раствор Tris - HCl, pH 7.6                          0.53 мл

0.2 M раствор NaEDTA                                    0.53 мл 

20% саркозил (водный раствор

лауроилсаркозината натрия)                          1.06 мл 

β – меркаптоэтанол                                        0.105 мл

Приготовление.

  1. Гуанидинтиоцианат растворить в воде, добавить растворы триса и ЭДТА. Прогреть при постоянном перемешивании до +60-70ºC, затем перемешивать при комнатной температуре несколько часов.
  2. Добавить саркозил.
  3. Довести объем смеси до 10.5 мл стерильной бидистиллированной водой.
  4. Профильтровать раствор с помощью шприца с фильтрующей насадкой (диаметр пор 0.22 мкм).
  5. Добавить β–меркаптоэтанол.

Хранить готовый буфер при температуре + 4ºC в темноте. 

Итоговый количественный состав буфера.

Гуанидинтиоцианат 4М, Tris – HCl 0.05М, натрия ЭДТА 0.01М, натрия лауроилсаркозинат 2%, β – меркаптоэтанол 1%. 

Б. Процедура выделения.

  1. 1. Поместить материал в гуанидин-тиоцианатный буфер, соблюдая соотношение объемов материала и буфера 1:10 – 1:5; при необходимости растереть объект в пробирке пестиком. Тщательно перемешать смесь с помощью вортекса.
  2. 2. Прогреть при температуре +72ºC в течение, как минимум, 5 мин., перемешать с помощью вортекса.
  3. 3. При необходимости: коротко центрифугировать на максимальной скорости, перенести прозрачный супернатант, содержащий ДНК, в новую пробирку, осадок выкинуть.
  4. 4. Добавить к пробе равный объем изопропанола. Тщательно перемешать переворачиванием пробирки. Осаждать ДНК при температуре -20ºC от 30 мин. до нескольких суток, в зависимости от ожидаемого количества ДНК.
  5. 5. Центрифугировать пробы 15 мин. на максимальной скорости центрифуги (13-15 000 об/мин или 10-15 000 g для стандартного ротора).
  6. 6. Осторожно удалить супернатант пипеткой. Внимание! Пеллет ДНК прозрачен и практически невидим! Обычно он осаждается на той стенке пробирки, которая была снаружи при центрифугировании! К этому участку стенки прикасаться нельзя!
  7. 7. Добавить 70% этанол в объеме, большем или равном объему смеси с изопропанолом. Коротко перемешать вортексом. Центрифугировать пробы 5 мин. на максимальной скорости центрифуги.
  8. 8. Осторожно удалить супернатант пипеткой, соблюдая меры предосторожности, указанные в п. 6.
  9. 9. Собрать остатки этанола на дне пробирки коротким центрифугированием. Удалить пипеткой. Подсушить осадок на воздухе 2-3 мин. до исчезновения запаха спирта. Внимание! Чем сильнее высушен осадок, тем хуже он растворяется!

Растворить осадок ДНК в воде, Трис-буфере или буфере TE со слегка щелочным pH. Хранить при -20ºC. 

Литература:

  • 1. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. 215 p.
  • 2. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analyt. Biochem. 1987. Vol. 162.P. 156-159. 

Амплификация фрагментов генома с помощью ПЦР

ПЦР основана на том, что в реакционной смеси, содержащей термостабильную Taq ДНК-полимеразу, смесь нуклеотидов, ДНК-матрицу (двухчепочечную ДНК, фрагмент которой необходимо наработать до препаративного количества) и олигонуклеотидные ДНК-затравки (праймеры), комплиментарные концевым участкам амплифицируемого фрагмента, происходит наращивание двухцепочечного фрагмента ДНК за счет синтеза дополнительных цепочек на расплетенных цепочках ДНК-матрицы. Реакция состоит из определенного количества циклов, каждый из которых состоит из трех этапов: (1) денатурация, в процессе которой происходит плавление двухцепочечной ДНК; (2) отжиг праймеров на ДНК-матрицу; (3) элонгация цепи, в процессе которой происходит синтез новых цепей ДНК, комплиментарных матрице, от 3’-концов праймеров. Синтез происходит за счет присоединения нуклеотидов к матрице по принципу комплиментарности и пришивания их к 3’-концу растущего фрагмента ДНК-полимеразой. В идеальном случае, в каждом цикле реакции количество фрагментов ДНК удваивается по сравнению с предыдущим циклом, поэтому в результате реакции синтезируется в 2n раза больше двухцепочечных молекул ДНК необходимого фрагмента, чем содержится в исходной смеси, где n – количество циклов реакции.

Литература:

  • Sambrook J., Russel D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction.

Амплификация ДНК-маркеров из изучаемых организмов без выделения ДНК с использованием метода single-cellPCR.

Методика используется в случае, если изучаемый организм не удается нарастить в культуре в достаточном для выделения тотальной ДНК количестве и/или очистить от других организмов. 

Очистка ПЦР-продуктов из реакционных смесей с использованием наборов реактивов EvrogenCleanupPCRpurificationkit

  1. Очистка продуктов ПЦР на колонке без выделения из геля.

Использование:

- очистка продуктов ПЦР от компонентов реакции;

- удаление олигонуклеотидных компонентов длиной до 70 н.п. (димерыпраймеров и т.п.), могущих отрицательно влиять на эффективность клонирования. 

  1. Очистка продуктов ПЦР на колонке из агарозного геля.

Использование:

- электрофоретическое отделение и удаление всех фрагментов ДНК, отличающихся по длине от нужного нам и являющихся результатом неспецифической амплификации;

- очистка продуктов ПЦР от компонентов реакции;

- удаление олигонуклеотидных компонентов длиной до 70 н.п. (димерыпраймеров и т.п.), могущих отрицательно влиять на эффективность клонирования. 

Оригинальный протокол:

http://evrogen.ru/kit-user-manuals/BC022.pdf