Генетический анализатор ABI Prism 3500xl представляет собой автоматический 24-капиллярный секвенатор, который может быть использован для различных приложений, требующих определения нуклеотидной последовательности и анализа размера и относительного количества фрагментов ДНК. Может применяться для сравнительного секвенирования, для обнаружения и подтверждения наличия мутаций и SNP, STR-, AFLP- и SSCP-анализов.
Размещение: Петергофская площадка.
Статус: эксплуатация в рабочем режиме.
Основные технические характеристики
| Число капилляров | 24 |
| Длина капилляров (см) | 36 или 50 |
| Тип полимера | POP-4™, POP-6™, POP-7™ |
| Количество одновременно детектируемых флюоресцентных меток (длина волны испускания) |
5 (525-650 нм) |
| Длина прочтения | более 850 нуклеотидов |
| Производительность прибора | 1272 форезов за сутки при использовании короткого капилляра и полимера POP-7 |
Принцип работы
Определение нуклеотидной последовательности основано на методе Сэнджера. Продукты ферментативной реакции секвенирования, флуоресцентно меченные дидезоксинуклеотидами, разделяются с помощью капиллярного электрофореза. При достижении полинуклеотидами детекционного окна в капилляре происходит возбуждение лазером флуоресцентной метки и детекция испущенной флуоресценции CCD-камерой. Программное обеспечение анализирует полученные сигналы (хроматограммы) и определяет последовательность нуклеотидов.
При анализе фрагментов ДНК каждый образец, представляющий собой смесь фрагментов, метится определенным флюоресцентным красителем. Затем четыре образца смешиваются с меченным стандартом длин, и на основании полученных хроматограмм программное обеспечение вычисляет размер и относительное количество фрагментов ДНК в образцах.
Методики
Вся необходимая информация по подготовке материала для секвенирования, проведению реакции секвенирования и интерпретации полученных результатов может быть найдена в руководстве "DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Applied Biosystems Chemistry Guide" (cms_041003.pdf).
Информация, касающаяся проведения фрагментного анализа с помощью капиллярного секвенатора, содержится в руководстве "GeneScan® Reference Guide Chemistry Reference for the ABI PRISM® 3500xl Genetic Analyzer" (cms_040961.pdf).
Требования к образцам
Для секвенирования принимаются образцы ДНК в виде плазмид или ПЦР-фрагментов. В случае ПЦР-фрагмента не должно быть видимой при электрофорезе в агарозном геле примеси нецелевых фрагментов, праймеров и геномной ДНК. Для секвенирования пригодны образцы ДНК, очищенные как с помощью различных "внутрилабораторных" методов, так и коммерческих наборов при условии растворения конечного препарата ДНК в воде.
Обязательным условием является определение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра, флюориметра или электрофореза в агарозном геле. Количество ДНК для постановки реакции секвенирования рассчитывается исходя из типа матрицы, ее размера и концентрации. В случае плазмидной ДНК необходимо предоставить не менее 300 нг на каждую реакцию секвенирования с концентрацией ДНК не ниже 50 нг/мкл. В случае ПЦР-фрагментов необходимое количество ДНК на одну реакцию можно сосчитать, поделив размер фрагмента в п.н. на 25, при этом концентрация ДНК должна быть не ниже 10 нг/мкл, а объем не менее 5 мкл.
Праймеры для секвенирования должны иметь концентрацию 10 пикомоль/мкл, а их объем должен составлять N микролитров, где N – число реакций секвенирования, которое нужно поставить с данного праймера, но не менее 5 мкл.
Инструкции по подготовке образцов к капиллярному секвенированию.
Форма заявки на капиллярное секвенирование.
Дополнительно
Результаты секвенирования в виде стандартных файлов формата *.ab1, названных в соответствии с заполненной заявкой на секвенирование (Ваши инициалы с датой заявки и порядковым номером "NS-ММ-ДД-###"), будут высланы на указанный в заявке адрес электронной почты. Файлы *.ab1 содержат как первичную ("сырую", без "букв"), так и процессированную хроматограммы и могут быть открыты и проанализированы бесплатными программами Chromas Lite или Sequence Scanner Software.
