Методика использования прибора QIAcxel Advanced

Прибор QIAcxel Advanced является инструментом для 12-канального капиллярного электрофореза, спроектированным для выполнения быстрого и полностью автоматизированного анализа фрагментов ДНК или качественного и количественного анализа РНК. Прибор разделяет ДНК и РНК согласно их молекулярному весу.

Подробная методика по использованию прибора для анализа ДНК: QIAxcel DNA Handbook https://www.qiagen.com/ru/resources/resourcedetail?id=f6158498-a857-4a2f-b40b-569fba3793e2&lang=en

Подробная методика по использованию прибора для анализа РНК: QIAxcel RNA Handbook https://www.qiagen.com/ru/resources/resourcedetail?id=e9f6cb28-0ae7-400d-b0de-19e734798aed&lang=en

 

Требования к образцам:

Рекомендуемые концентрации:

Тип образца

Рекомендуемая минимальная концентрация (нг/мкл)

ДНК

>0.1 нг/мкл

тРНК

50-1000

кРНК или онРНК

любая

фрагментированная кРНК или кДНК

250

Минимальный объем –10 мкл.

До необходимой концентрации образцы ДНК можно разводить, например, в QX Dilution Buffer, ампулированной или деионизованной воде и др. Образцы РНК можно разводить только в деионизованной воде.

Для непосредственного анализа используется 0.1 мкл. Оставшиеся образцы ДНК можно использовать для дальнейшей работы, например для секвенирования или клонирования, но не для амплификации. Образцы РНК нельзя использовать для дальнейшего анализа.

 

Анализ ДНК

Необходимые материалы:

  • Гелевый ДНК картридж.
  • Выравнивающий маркер для ДНК. Его следует менять каждые 50 запусков или 3 дня. Для приготовления нового маркера следует залить 15 мкл выравнивающего маркера в каждую лунку стрипа и добавить по капле минерального масла также во все 12 лунок стрипа.  
  • Размерный маркер для ДНК. Размерный маркер не обязательно добавлять в каждый запуск, можно через 8. Однако в этом случае картридж и метод анализа должны быть одинаковыми для всех запусков.
  • Разбавочный буфер.
  • В случае замены картриджа необходимы следующие реагенты:
    • промывочный буфер;
    • разделительный буфер;
    • маркер калибровки интенсивности.
  • Все реагенты и образцы должны быть приведены к комнатной температуре.

Перед тем, как начать:

  1. Выбрать размерный маркер, близкий по размерам к анализируемым образцам. Размер интересующих фрагментов должен быть меньше максимального пика размерного маркера. Также размерный маркер должен соответствовать выравнивающему маркеру, используемому при анализе (смотри: стр. 20 QIAxcel DNA Handbook с таблицей соответствия маркеров).
  2. Развести размерный маркер. Если образцы были разведены в разбавочном буфере, следует развести маркер с начальной концентрации 100 нг/мкл до 5 нг/мкл также в разбавочном буфере. Если образцы были взяты неразбавленные, следует развести маркер 1х ПЦР буфером или 1х рестриктазным буфером до 10 нг/мкл для метода L (низкая концентрация образца), 30 нг/мкл для метода M (средняя концентрация образца) и 50 нг/мкл для метода H (высокая концентрация образца) (смотри: описание методов на стр. 38-40 QIAxcel DNA Handbook).

Подготовка прибора и запуск анализа:

  1. В программе QIAxcel ScreenGel выбрать режим ДНК.
  2. Поставить картридж в прибор и вставить смарт-ключ в специальный разъем.
  3. Установить выравнивающий маркер в лоток MARKER.
  4. Загрузить образцы.
  5. Выбрать профиль процесса (набор для анализа, метод – подробное описание смотри на стр. 38-40 QIAxcel DNA Handbook для набора High Resolution Kit), ввести информацию об образцах.

Краткое описание методов:

Размер фрагментов

 

100-500 bp

500-1 kb

1-5 kb

5-10 kb

Метод

Наилучшее разрешение

OM400

OL400

OH400

20 bp

100 bp

500 bp

N/A

OM500

OL500

OH500

10 bp

50 bp

200 bp

N/A

OM800

OL800

OH800

3-5 bp

N/A

N/A

N/A

OM1200

OL1200

OH1200

N/A

N/A

500 bp -1 kb

1-1.5 kb

Методы OL – для образцов с низкой концентрацией <10 нг/мкл.

Методы OM – для образцов со средней концентрацией 10-100 нг/мкл.

Методы OH – для образцов с высокой концентрацией >100 нг/мкл.

  1. В программе выбрать размерный маркер, если он используется и выравнивающий маркер.
  2. Для запуска анализа нажать Run.

Анализ результатов:

  1. Выделить ячейку с маркером и открыть Gel Image.
  2. Во вкладке Analysis выбрать "No Marker" и нажать "Start Analysis".
  3. Открыть вкладку Reference Marker и выбрать тип размерного маркера, указать его концентрацию. Нажать "Apply". Если требуется, можно сохранить данный маркер для дальнейших запусков.
  4. Открыть вкладку Gel Image со всеми образцами и маркером, выделить все и нажать "Start Analysis", для того, чтобы распознать размер фрагментов в анализируемых образцах.

После работы:

  1. Выключить компьютер.
  2. Если картридж не используется ежедневно, заклеить отверстие на обратной стороне картриджа клейким колпачком, вложить картридж в блистерную упаковку, вставить носики в гель и убрать в холодильник. Убрать в холодильник выравнивающий маркер в стрипе. Если картридж будет использоваться в течение дня или на следующий день, его можно хранить в приборе в позиции "Park".
  3. Выключить прибор.

 

Анализ РНК

Необходимые материалы:

  • гелевый РНК картридж;
  • выравнивающий маркер для РНК. Его следует менять через каждые 20 запусков или 3 дня. Если нужно приготовить новый маркер: залить по 15 мкл выравнивающего маркера в каждую лунку стрипа и добавить по капле минерального масла также во все 12 лунок стрипа; 
  • размерный маркер для РНК. Размерный маркер следует запускать, когда используется новый картридж. В остальных случаях, маркер запускать не требуется;
  • разбавочный буфер.

В случае замены картриджа, необходимы следующие реагенты:

  • промывочный буфер;
  • маркер калибровки интенсивности.

Все реагенты и образцы должны быть приведены к комнатной температуре.

Перед тем, как начать:

  1. Образцы нужно разбавить деионизованной водой до концентраций, указанных в таблице в зависимости от типа РНК и выбранного метода.

Рекомендуемые РНК концентрации и методы.

Тип РНК

Рекомендуемая минимальная концентрация (нг/мкл)

 

Метод

тРНК

300-1000

CM - RNA

50-300

CL - RNA

кРНК или онРНК

100-500

CM - RNA

<100

CL - RNA

фрагментированная кРНК или кДНК

250-500

CM - F - RNA

 

  1. Добавить по 1 мкл РНК в лунки стрипа, также добавить 1 мкл неразбавленного выравнивающего РНК маркера.
  2. Добавить одинаковое количество денатурирующего буфера.
  3. Нагреть раствор до 70ºС на 2 мин. в ПЦР и поставить на лед на 1 мин.
  4. Центрифугировать пробирки.
  5. Привести объем в пробирках стрипа до 10 мкл разбавочным РНК буфером.

Подготовка прибора и запуск анализа:

  1. В программе QIAxcel ScreenGel выбрать режим РНК.
  2. Поставить картридж в прибор и вставить смарт-ключ в специальный разъем.
  3. Установить выравнивающий маркер в лоток MARKER.
  4. Загрузить образцы.
  5. Выбрать профиль процесса, ввести информацию об образцах.
  6. Для запуска анализа нажать "Run".

Анализ результатов:

  1. Выделить ячейку с маркером и открыть Gel Image.
  2. Во вкладке Analysis выбрать "No Marker" и нажать "Start Analysis".
  3. Открыть вкладку Reference Marker и выбрать тип размерного маркера, указать его концентрацию. Нажать "Apply". Если требуется, можно сохранить данный маркер для дальнейших запусков.
  4. Открыть вкладку Gel Image со всеми образцами и маркером, выделить все и нажать "Start Analysis", для того, чтобы распознать размер фрагментов в анализируемых образцах.

Оценка качества РНК:

  1. Открыть вкладку RNA Integrity Score (RIS). Для эукариот в Ratio Normalized Area выбрать 28S пик и 18S пик. Для прокариот в Ratio Normalized Area выбрать 23S пик и 16S пик.
  2. Нажать "Start Peak Calling". Значение RIS варьируется в пределах от 1 до 10, в зависимости от степени деградации РНК, где 10 – это минимально деградированная РНК. Для приготовления библиотеки следует брать образцы с RIS не менее 6.

После работы:

  1. Выключить компьютер.
  2. Если картридж не используется ежедневно, заклеить отверстие на обратной стороне картриджа клейким колпачком, вложить картридж в блистерную упаковку, вставить носики в гель и убрать в холодильник. Убрать в холодильник выравнивающий маркер в стрипе. Если картридж будет использоваться в течение дня или на следующий день, его можно хранить в приборе в позиции "Park".
  3. Выключить прибор.

Полученные результаты:

Программное обеспечение QIAxcel ScreenGel, поставляемое с прибором QIAcxel Advanced, дает возможность получить как электроферограммы, так и изображения гелей с ДНК, а также может использоваться для проведения анализа размеров и концентраций фрагментов ДНК, определения соотношения, концентрации и качества общей РНК, качества кРНК / кДНК и фрагментированной РНК / ДНК.

Замена буферов (перед тем, как использовать новый картридж):

  1. Все реагенты должны быть приведены к комнатной температуре.
  2. Заполнить позиции WP и WI в лотке для буферов 8 мл промывочного буфера.
  3. Заполнить позицию BUFFER 18 мл разделительного буфера.
  4. Добавить 2 мл минерального масла в WP и WI, а также 4 мл в BUFFER.
  5. Вставить держатель для буферов обратно в прибор.

Замена картриджа (после того, как использован старый):

  1. Добавить 10 мл промывочного буфера в оба резервуара подставки для картриджа.
  2. Достать новый картридж из блистерной упаковки и аккуратно вытереть капиллярные носики от геля.
  3. Убрать клейкий колпачок с обратной стороны картриджа и поставить в держатель.

Калибровка нового картриджа:

  1. Снять клейкий колпачок с картриджа, поставить в прибор лейблом вперед и вставить смарт-ключ в специальный разъем.
  2. Залить по 15 мкл маркера для калибровки интенсивности в каждую лунку стрипа с цветными пробирками на 0.2 мл и добавить по капле минерального масла также во все 12 лунок стрипа.
  3. Установить маркер для калибровки интенсивности в лоток MARKER.
  4. Нажать "Start Calibration" во вкладке "Service" программы QIAxcel ScreenGel.
  5. Успешно откалиброванный картридж должен иметь нормализованное значение в пределах 0.004-0.0065.