Сканирующий спектрофлуориметр Agilent Cary Eclipse.
Назначение: спектрофлуориметрия (=флуоресцентная спектроскопия) представляет собой мощный и информативный метод исследований, главным образом, динамических процессов в растворах. Однако может быть также использован для количественного и качественного анализов образцов.
Основными оцениваемыми параметрами являются флуоресцентный спектр (по возбуждению или по эмиссии) и интенсивность флуоресценции, что позволяет проводить качественный и количественный анализ образцов соответственно: по характеристикам спектра можно идентифицировать флуорофор, по интенсивности флуоресценции определить его концентрацию (если она попадает на участок линейной зависимости, определяемые концентрации могут составлять нг/мл). Оценка данных параметров может иметь также и другие прикладные выходы. Так, смещение максимума эмиссии может свидетельствовать об изменении окружения флуорофора (например, включении белка в мицеллы), а изменение интенсивности – о взаимодействии флуорофора с другой молекулой (например, краситель sybr green начинает флуоресцировать с большей интенсивность после взаимодействия с ДНК).
Существуют также дополнительные параметры, измерение которых может характеризовать состояние образца:
- флуоресцентная анизотропия, т.е. степень поляризованности флуоресцентного излучения после возбуждения поляризованным светом – характеризует степень подвижности флуорофора; может использоваться для получения данных о жесткости, содержащей флуорофор молекулы (например, стабильность белковой глобулы), или о включении ее в надмолекулярный комплекс и подвижности в этом комплексе (например, белков в липидном бислое);
- скорость гашения флуоресценции – характеризует доступность флуорофора для агентов, влияющих на процесс флуоресценции; электрон-доноры (ОН, NH2 и пр.) увеличивают ее продолжительность, электрон-акцепторы (СООН, NO2 и пр.) – наоборот; так можно оценить, например, степень упакованности белковой глобулы (точнее доступность триптофановых остатков для действия внешних агентов), а также концентрацию самих агентов (например, рН раствора, концентрацию О2 и пр.);
- форстеровский резонансный энергетический перенос (FRET) – случай, когда происходит возбуждение второго флуорофора путём безизлучательной передачи энергии с первого флуорохрома, возбужденного лучом источника; характеризует возможность взаимодействия между двумя флуорофорами – гибкость молекулы (если они "пришиты" к разным частям одной молекулы) или ее целостность (если эта молекула подвергается гидролизу), а также расстояние между флурофорами (т.е. в насколько тесный контакт входят два помеченные вещества).
Размещение: Василеостровская площадка.
Статус: эксплуатация в рабочем режиме.
Основные технические характеристики
Источник оптического возбуждения – импульсная ксеноновая лампа с частотой вспышек не кратной сетевому току 80 Гц.
Длительность импульсов – от 2-х микросекунд, эквивалентная мощность под пиком 75 кВт.
Два независимых монохроматора Черни-Тернера с фокальной плоскостью 0.125 м.
Оптика Шварцшильда с кварцевым покрытием оптических элементов.
Дифракционные решетки – 1200 линий/мм.
Максимальная скорость сканирования спектров – 24 000 нм/мин как по возбуждению, так и по эмиссии.
Выбор ширины в диапазоне 1.5-10 нм.
Кюветное отделение возможность работы с кюветами и планшетами.
Доступ в кюветное отделение как сверху, так и с фронтальной стороны прибора.
Возможность работы с внешней засветкой с открытым отделением для образцов.
Спектральный диапазон – 190-1 100 нм.
Гарантированные фотометрические характеристики.
В диапазоне 200-900 нм.
Точность установки длины волны – 1.5 нм.
Спектральное разрешение – 1.5 нм.
Воспроизводимость по длинам волн – 0.2 нм.
Два независимых малошумящих фотоумножителя.
Чувствительность (Рамановская линия воды, время усреднения не более 1 с) на длине волны 350 нм – 750:1.
Чувствительность (Рамановская линия воды, время усреднения не более 1 с) на длине волны 500 нм – 500:1.
Скорость сбора кинетических данных 4800 точек в мин.
Временные параметры в диапазонах флуоресценции – 0.02-999 с.
Временные параметры фосфоресценции – 1 мкс-10 с.
Временные параметры био/хеми- люминесценции – 40 мкс-10 с.
Микропланшетный считыватель для стандартных плашек на 384 позиции.
Измерение флуоресценции в стандартных плашках на 384 позиции – 90 с.
Измерение флуоресценции в стандартных плашках на 96 позиций – 50 с.
Возможность установки планшетов нестандартного размера.
Программное обеспечение, в которое входят следующие возможности – сканирование, концентрация, время жизни, измерения на заданной длине волны, измерение при изменении температуры, возможность валидирования результатов.
Автоматический поляризатор излучения возбуждения и люминесценции.
Держатель для твёрдых образцов.
Оптоволоконная приставка.
Термостатируемый многопозиционный держатель на элементах Пельтье.
Максимальное число кювет в держателе – 4.
Температурный диапазон – 0-100°С
Стабильность поддержания температуры температуры – ±0.05оC.
Максимальная разница температуры между ячейками (при 37оС) – 0.2оС.
Температурный контроллер.
Температурный датчик.
Водяной насос для отвода тепла для Пельтье элемента в комплекте.
Набор магнитных мешальников – 10 шт.
Дверь расширенного кюветного отделения для установки термостатируемых держателей.
Держатель с водяным термостатированием на одну кювету.
Диапазон температур 20-60оС.
Циркуляционный охладитель для держателя в комплекте.
Принцип работы
В отличие от спектрофотометрии, которая оценивает поглощение, спектрофолуориметрия оценивает эмиссию. Это определяет положение детектора в приборе – под углом 90о по отношению к направлению возбуждающего луча, чтобы детектируемый сигнал минимально зашумлялся непоглощенным возбуждающим излучением. Прибор может работать в двух режимах, т.к. снабжен двумя монохроматорами после источника возбуждения и перед детектором излучения: либо удерживается возбуждающая длина волны и снимается спектр излучения, либо, наоборот, получают кривую интенсивности излучения на одной длине волны при варьировании длины волны возбуждающего света.
Требования к образцам
Наличие молекулярного кислорода в образцах снижает интенсивность флуоресценции, поэтому желательно пробы деаэрировать.
