Методика постановки полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на приборе Applied Biosystems 7500 Real Time PCR fast (анализ экспрессии генов)

Описание прибора:

Прибор Applied Biosystems 7500 Real Time PCR предназначен для количественного определения нуклеиновых кислот и качественного определения последовательностей нуклеиновых кислот. Указанные типы анализов обеспечиваются с помощью флуоресцентно меченых реагентов для проведения ПЦР и анализа полученных результатов в режиме реального времени с использованием конечных данных и кривой диссоциации.

Реактивы и материалы:

  • MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode,
  • TaqMan® Fast Advanced Master Mix,
  • TaqMan® Gene Expression Assay,
  • TaqMan® Gene Expression Controls,
  • кДНК.

Порядок действий при выполнении анализа:

  1. 1. Подготовка реакционного планшета.
    • Отметить на схеме реакционного планшета расположение лунок с образцами.
      Приготовить смесь в соответствии с таблицей:

    • Нанести готовую смесь на реакционный планшет в выбранные для анализа лунки.
      Добавить по 2 мкл кДНК в соответствующие лунки.
      Закрыть лунки прозрачной пленкой.
      До установки в прибор реакционный планшет следует хранить на льду. 

 

  1. 2. Создать документа в программе ABI 7500 software.
  3. Выбрать в колонке Set Up раздел Advanced Setup.
    В открывшейся вкладе ввести:
       в строке Experiment Name – имя эксперимента,
       прибор – 7500 Fast (96 Wells),
       тип анализа – ΔΔСt,
       используемые реагенты – TaqMan® Reagents,
       скорость анализа – Fast.
    Нажать клавишу "Next".
    В открывшейся вкладке ввести количество и названия проб и мишеней.
    Перейти в правую вкладку и определить положение проб, контролей и мишеней на планшете.
    Выбрать мишень – эндогенный контроль и пробу, относительно которой будет проводиться анализ.
    Нажать клавишу "Next".
    В открывшейся вкладке ввести ввести:
  •      объем реакционной смеси – 20 мкл,
  •      количество циклов – 40.
  • Задать следующую программу для работы прибора:

  • После этого выбрать опцию File > Save As, ввести название документа, затем нажать на клавишу "Save".
    Установить планшет в прибор.
    Нажать на клавишу "Start run". После завершения цикла на экран выводится сообщение об успешно проведенном цикле или о допущенных ошибках.
  1. 3. Анализ данных.
    • Для анализа данных нажать на клавишу "Analyze".
      При необходимости отрегулировать вручную базовую линию и пороговое значение сигнала.
      Просмотреть результаты анализа.

ВАЖНО! При анализе обратить внимание на параметры, помеченные желтыми флажками.