Описание прибора:
Прибор Applied Biosystems 7500 Real Time PCR предназначен для количественного определения нуклеиновых кислот и качественного определения последовательностей нуклеиновых кислот. Указанные типы анализов обеспечиваются с помощью флуоресцентно меченых реагентов для проведения ПЦР и анализа полученных результатов в режиме реального времени с использованием конечных данных и кривой диссоциации.
Реактивы и материалы:
- MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode,
- Master Mix с SYBR Green I, 2х conc.,
- праймеры,
- ДНК.
Порядок действий при выполнении анализа:
- 1. Подготовка реакционного планшета.
- Отметить на схеме реакционного планшета расположение лунок с образцами.
В 1.5 мл пробирке на льду приготовить смесь для проведения ПЦР в соответствии с таблицей:
- Нанести готовую смесь на реакционный планшет в выбранные для анализа лунки.
Добавить по 5 мкл исследуемой ДНК или стандарта в соответствующие лунки.
Закрыть лунки прозрачной пленкой.
До установки в прибор реакционный планшет следует хранить на льду.
- 2. Создать документа в программе ABI 7500 software.
- Выбрать в колонке Set Up раздел Advanced Setup.
В открывшейся вкладе ввести:
в строке Experiment Name – имя эксперимента,
прибор: 7500 Fast (96 Wells),
тип анализа: Absolute Quantification (Standard Curve),
используемые реагенты: SYBR Green 1,
скорость анализа: Fast.
Нажать клавишу "Next".
В открывшейся вкладке ввести количество и названия проб и мишеней.
Перейти в правую вкладку и определить положение проб, контролей и мишеней на планшете.
Нажать клавишу "Next".
В открывшейся вкладке ввести ввести:- объем реакционной смеси – 20 мкл,
- количество циклов – 45,
- Задать следующую программу для работы прибора:
- После этого выбрать опцию File > Save As, ввести название документа, затем нажать на клавишу "Save".
Установить планшет в прибор.
Нажать на клавишу "Start run". После завершения цикла на экран выводится сообщение об успешно проведенном цикле или о допущенных ошибках.
- 3.Анализ данных.
- Для анализа данных нажать на клавишу "Analyze".
При необходимости отрегулировать вручную базовую линию и пороговое значение сигнала.
Просмотреть результаты анализа.
ВАЖНО! При анализе обратить внимание на параметры, помеченные желтыми флажками.