Метод проточной цитометрии позволяет измерять физические и химические параметры отдельных клеток или частиц. Он основан на регистрации флуоресценции и светорассеяния от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в струе жидкости. Данный метод чаще всего применяется при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. На приборе можно также исследовать диссоциированные клетки любых тканей, бактериальные клетки, микропланктон, флуоресцентные микросферы с зондами.
Прибор может быть использован для:
1. анализа клеток и частиц. Позволяет:
- • идентифицировать отдельные классы, подклассы, популяции, субпопуляции, измерять их поверхностные или внутриклеточные маркеры;
- • оценивать функциональное состояние клеток (митохондриальный потенциал, внутриклеточный кальций, pH) с использованием специальных ратиометрических красителей (FDA, DiOC1, JC -1 и др.);
- • оценивать функциональное состояние клеток с помощью специфических антител к фосфорилированным и не-фосфорилированным формам изучаемых белков;
- • проводить многопараметрический (многоцветный) анализ проб;
- • проводить анализ параметров клеточного цикла и содержания ДНК в живых и фиксированных клетках;
- • изучать кинетические параметры клеточных процессов (повреждение клеточных мембран, ферментативная активность);
- • исследовать механизмы и стадии апоптоза с использованием разнообразных маркеров и зондов;
- • проводить изучение фагоцитоза, в том числе в нейтрофилах крови и макрофагах;
- • исследовать чувствительность клеток к цитостатикам путем определения уровня экспрессии белков (P-gp и др.);
- • проводить молекулярно-генетические исследования (изучение отдельных хромосом и экспрессии генов);
- • исследовать проточное кариотипирование хромосом с использованием флуоресцентных зондов.
2. сортировки клеток и частиц. Способен сортировать до 4 фракций одновременно из одного образца с максимальной скоростью сортировки 70000 частиц в секунду.
Размещение: Василеостровская площадка.
Статус: эксплуатация в рабочем режиме.
Основные технические характеристики
Лазеры
- • Фиолетовый 405 нм (мощность 50 мВт).
- • Синий 488 нм (мощность 20 мВт).
- • Красный 633 нм (мощность 18 мВт).
Позволяют регистрировать 13 первичных параметров: 2 параметра светорассеяния (forward scatter, side scatter) и 11 параметров флуоресценции.
Фильтры и рекомендуемые флуорохромы
- • Для лазера с длиной волны 405 нм: одновременная регистрация сигнала от трех флуорохромов:
545LP ----- 560/40 ----- BV605, Pacific Orange, Alexa Fluor 430
502LP ----- 510/50 ----- BV510, V500, AmCyan
450/40 ----- V450, BV421, Pacific Blue, DAPI, Alexa Fluor 405
- • Для лазера с длиной волны 488 нм: одновременная регистрация сигнала от пяти флуорохромов:
735LP ----- 780/60 ----- PE-Cy7
655LP ----- 695/40 ----- PerCP-Cy5-5, PerCP, PE-Cy5, 7-AAD
610LP ----- 616/23 ----- PE-CF594, PE-Texas Red, PI
556LP ----- 585/42 ----- PE
502LP ----- 530/30 ----- Alexa Fluor488, FITC, CFSE
488/10 ----- SSC
- • Для лазера с длиной волны 633 нм: одновременная регистрация сигнала от трех флуорохромов:
735LP ----- 780/60 ----- APC-Cy7, APC-H7
690LP ----- 730/45 ----- Alexa Fluor700
660/20 ----- APC, Alexa Fluor 647
Сопла (nozzle) для сортировки
70 мкм, 85 мкм, 100 мкм, 130 мкм.
Сортировочные емкости
Возможность сортировки в пробирки объемами 5 мл, 15 мл, микропробирки, в 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, на стекла.
Температура
Анализ и сортировка образца при температуре: 4°C, 20°C, 37°C и 42°C.
Оптическая система
-
• Представлена тремя лазерами с пространственно разделенными лазерными лучами:
- 1) с длиной волны 488 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 20 мВт.
- 2) с длиной волны 633 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 18 мВт.
- 3) с длиной волны 405 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 50 мВт.
-
• Фиксированная, не требует пользовательской юстировки.
-
• Позволяет регистрировать 13 первичных оптических параметров, включая 2 параметра светорассеяния и 11 параметров флуоресценции.
-
• Возможно дооснащение дополнительными фотоэлектронными умножителями, дихроическими зеркалами и фильтрами для увеличения числа регистрируемых параметров флуоресценции до 18 и более.
Детекторная система
Представлена:
-
• детекторным блоком Octagon с круговым расположением шести фотоэлектронных умножителей и гнездами для восьми пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации бокового светорассеяния и сигнала от пяти флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 488 нм.
Набор дихроических зеркал 502ФНЧ, 556ФНЧ, 610ФНЧ, 655ФНЧ, 735ФНЧ и фильтров 488/10, 530/30, 585/42, 616/23, 695/40, 780/60 для регистрации бокового светорассеяния и сигнала от пяти флуорохромов (FITC, PE, PE-TR, PepCP-Cy5.5, PE-Cy7 или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 488 нм;
-
• детекторным блоком Trigon с круговым расположением трех фотоэлектронных умножителей и гнездами для трех пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации сигнала от трех флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 633 нм.
Набор дихроических зеркал 690ФНЧ, 735ФНЧ и фильтров 660/20, 730/45, 780/60 для одновременной регистрации сигнала от трех флуорохромов (APC, AlexaFluor700, APC-Cy7 или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 633 нм;
-
• детекторным блоком с круговым расположением трех установленных фотоэлектронных умножителей и гнездами для трех пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации сигнала от флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 405 нм.
Дихроическое зеркало 545ФНЧ, 502ФНЧ и фильтры 450/40, 510/50, 560/40 для одновременной регистрации сигнала от трех флуорохромов (PacificBlue, PacificOrange, AmCyan или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 405 нм;
• детектором для регистрации переднего светорассеяния – фотодиод с фильтром 488/10 нм.
Наименьшее регистрируемое количество флуоресцентного сигнала прибором – 85 эквивалентов FITC (флуоресцеин изотиоцианат), 30 эквивалентов PE (фикоэритрин).
Сбор и обработка сигналов при анализе и сортировке
-
• Цифровая система регистрации сигнала с разрешением 18 бит.
-
• Поддерживается регистрация значений высоты, ширины и площади пика для сигналов от единичных клеток для всех регистрируемых первичных параметров.
-
• Скорость сбора данных – до 70 000 событий в секунду при регистрации 8 первичных параметров.
-
• Сбор и анализ цитометрических данных в стандартах FCS 3.0 и FCS 2.0 (стандарты хранения данных, принятые в проточной флуорицитометрии).
Система сортировки
-
• Сортировка клеток и частиц методом разделения капель в потоке.
-
• Возможность сортировки в пробирки объемами 5 мл, 15 мл, микропробирки, в 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, на предметные стекла и другие емкости для сбора клеток поддерживается встроенным в прибор блоком ACDU.
-
• Поддерживается возможность сортировки до 4 фракций одновременно из одного образца.
-
• Скорость сортировки до 70 000 частиц в секунду (включительно) при регистрации 8 первичных параметров в предлагаемой конфигурации.
-
• Регулировка частоты привода образования капель с максимальным значением 100 000 Гц.
-
• Полупроводниковый красный лазер и встроенная CCD-камера для регистрации свечения калибровочных флуоресцентных частиц в основном и боковых потоках в процессе сортировки частиц при настройке параметра задержки капли.
-
• Автоматическая система Accudrop для настройки и верификации параметра задержки капли в режиме реального времени при сортировке калибровочных флуоресцентных частиц, исключающая необходимость контрольной сортировки калибровочных частиц или клеток на предметные стекла и подсчета частиц.
-
• Чистота сортировки в режиме чистого выделения клеток до 98% и более (до 99.9% в зависимости от условий эксперимента).
-
• Логика сортировки на основе предустановленных шаблонов чистоты и выхода сортировки с 32 градациями тонкой настройки масок сортировки.
-
• Автоматический мониторинг стабильности параметров сортировки и положения точки формирования капель в процессе работы при помощи функции SweetSpot (выполняется программным обеспечением прибора).
-
• Автоматическая корректировка параметров сортировки при изменении положения точки формирования капель, выполняемая без вмешательства оператора при помощи функции SweetSpot (выполняется программным обеспечением прибора).
-
• Полностью закрытая камера с регулируемым давлением для размещения пробирок с сортируемыми образцами объемами на 1.5 мл, 5 мл, 15 мл.
-
• Настраиваемая остановка сортировки при риске контаминации сортируемых фракций
-
• Система термостатирования сортируемого образца и собираемых фракций при работе с пробирками и планшетами: термостатирование сортируемого образца на установках температуры 4, 20, 37, и 42°C, термостатирование собираемых фракций в диапазоне до 50°C.
-
• Поддерживается возможность сортировки заданного числа клеток или частиц (от 1 частицы).
-
• Поддерживается возможность сортировки клеток разных субпопуляций в одну емкость для сбора фракций или в лунку планшета в соответствии с заданной оператором пропорцией.
Гидравлическая система
-
• Проточная система на основе проточной кюветы, не требующая пользовательской настройки.
-
• Поддерживается возможность автоклавирования емкостей для проточной жидкости при подготовке к стерильной сортировке.
-
• Автоматические протоколы для промывки прибора перед началом и в конце работы, для дезинфекции прибора перед стерильной сортировкой, для промывки проточной кюветы и порта подачи образца – поддерживаются программным обеспечением прибора.
-
• В комплект входят сменные сопла, обеспечивающие фиксированное, не требующее регулировки, положение потока на выходе из проточной кюветы.
-
• Сменные сопла для сортировки в комплекте, размеры: 70 мкм, 85 мкм, 100 мкм, 130 мкм.
Программное обеспечение FACSDIva
-
• Пакет инструментов для обработки цитометрических данных, включая инструменты гейтинга, квадрантов, регионов, расчет статистики входит в программное обеспечение FACSDiva.
-
• Поддерживается возможность проведения анализа данных на основе иерархических определений клеточных популяций без использования логических комбинаций гейтов.
-
• Поддерживается ведение базы данных по результатам и настройкам экспериментов с поиском по ключевым словам.
-
• Автоматическая функция определения положения популяции клеток на графике при сдвиге интенсивности флуоресцентного сигнала при исследовании серии проб выполняется программным обеспечением FACSDiva.
-
• Поддерживается отображение данных на графиках с логарифмическими осями диапазона 7 декад.
-
• Поддерживается функция программной компенсации взаимного влияния регистрируемых флуоресцентных сигналов.
-
• Поддерживается функция настройки произвольного масштаба графиков для отображения данных, вплоть до отображения данных по единичным регистрируемым каналам.
-
• Программное обеспечение для анализа клеточного цикла ModFIT.
-
• Программное обеспечение для мультиплексных технологий анализа FCAPArray.
Калибровка и настройка прибора
-
Программное обеспечение FACSDiva содержит встроенный протокол для автоматической проверки характеристик прибора (интенсивность, коэффициент вариации, эффективность сигнала, уровень шума) по калибровочным частицам для каждого регистрируемого параметра.
-
Имеются встроенные в программное обеспечение FACSDiva средства ведения файлов Леви-Дженнингс по данным проведенных калибровок для мониторинга стабильности прибора.
-
Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматическую настройку детекторов и мониторинг настроек по калибровочным частицам для флуорохромов: Indo 1, DAPI, Hoechst, Pacific Blue™, AmCyan, Qdot® 655, Qdot® 700, FITC, PE, PE-Texas Red™, PerCP, PerCP-Cy™5.5, PECy™7, APC, Alexa Fluor® 700, APC-Cy7, APC-HL750, их эквивалентов и др.
-
Программное обеспечение FACSDiva поддерживает возможность ручного подбора пользовательских настроек детекторов.
-
Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматический расчет параметров цветовой компенсации для всех возможных сочетаний регистрируемых параметров с использованием различных калибровочных материалов:
- – по контрольным клеткам, окрашенным флуоресцентными антителами,
- – по контрольным частицам, окрашенным флуоресцентными антителами.
-
Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматический расчет интенсивности свечения флуоресцентных частиц в боковом и центральном потоке при калибровке параметра задержки капли.
Требования к образцам
Перед подготовкой эксперимента, планируемого проводить на проточном цитофлуориметре, необходимо:
1. согласовать параметры эксперимента со специалистом Татьяной Чудиновой (желательно провести согласование до закупки флуоресцентных красителей и подготовки образцов) и прислать ей подробное описание эксперимента (см. ниже);
2. записаться у специалиста на работу на приборе (свободные и занятые дни можно увидеть в календаре занятости прибора).
1) Требования к нативному образцу
На проточном цитометре можно исследовать только диссоциированные биологические образцы (клетки или частицы). Все образцы должны быть профильтрованы. Можно исследовать:
- - диссоциированные клетки любых тканей или культур,
- - бактериальные клетки,
- - микропланктон,
- - флуоресцентные микросферы с зондами.
2) Требования к меткам
При работе на проточном цитометре можно использовать только флуоресцентные красители. При планировании эксперимента с использованием многоцветного анализа тщательно подбирайте комбинации флуорохромов в соответствие с установленными на приборе лазерами (на FACSAriaIII на данный момент установлены три стандартных твердотельных лазера: фиолетовый 405 нм, синий 488 нм и красный 633 нм) и фильтрами (см. технические характеристики)! Перед началом эксперимента выбор флуорохромов должен быть согласован со специалистом.
Общие требования к флуорохромам, используемым для многоцветного анализа
- - Флуорохромы должны быть биологически инертны.
- - Интенсивность флюоресценции флуорохрома, связанного с клеткой / частицей, должна быть высокой.
- - Спектральное перекрытие эмиссии флуорохромов и соответственно компенсация должны быть минимальны (см. таблицу).
- - В случае иммуногистохимического окрашивания флуорохромы должны легко соединяться с первичными / вторичными антителами.
- - Использование традиционных флуорохромов преимущественно перед использованием тандемных флуорохромов.
Также для подбора комбинаций флуорохромов для многоцветного анализа можно использовать спектральный гид: http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrumguide/.
Флуорохромы, рекомендуемые использовать на данном приборе: см. выше в Основных технических характеристиках.
3) Комплект образцов для проведения эксперимента
- Неокрашенный образец: 300 000 - 500 000 событий (клеток) в 1 мл раствора (PBS, BD Cell Wash, др.)
- Образцы, покрашенный отдельно каждым флуоресцентным красителем (для тех флуорохромов, для которых нужна компенсация): 100 000 событий (клеток) в 0.5 мл раствора (для расчета компенсации).
- Экспериментальный образец (покрашенный всеми флуоресцентными красителями): в зависимости от того, сколько событий нужно проанализировать.
Данные значения указаны в среднем для неуникального образца. Если образец уникальный или хорошо известный (например, кровь человека) значения можно изменять.
Оптимально предоставлять образцы в 1.5-2 мл эппендорфах или в 5 мл пробирках.
4) Описание эксперимента: необходимо прислать специалисту подробное описание части эксперимента, которая будет выполняться на проточном цитометре, по электронной почте:
- 1. все популяции клеток, присутствующие в нативном образце (желательно нарисовать график (SSC, FSC) популяций клеток в образце и выделить на нем интересующею вас популяцию, которую вы планируете анализировать). Либо вместо графика можно прислать перечень популяций клеток в образце с указанием размеров клеток и их относительной гранулированности (!);
- Пример:
- 2. исследуемые параметры: какими флуоресцентными маркерами (желательно указать производителя) они помечены;
- 3. какие лазеры и фильтры используются для регистрации каждого параметра (техн. харатеристики см. выше);
- 4. по каким параметрам Вы собираетесь анализировать (и сортировать) интересующие Вас субпопуляции. Написать четкую схему.
