Методика постановки полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на приборе Applied Biosystems 7500 Real Time PCR fast (количественный анализ)

Описание прибора:

Прибор Applied Biosystems 7500 Real Time PCR предназначен для количественного определения нуклеиновых кислот и качественного определения последовательностей нуклеиновых кислот. Указанные типы анализов обеспечиваются с помощью флуоресцентно меченых реагентов для проведения ПЦР и анализа полученных результатов в режиме реального времени с использованием конечных данных и кривой диссоциации.

Реактивы и материалы:

  • MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode,
  • Master Mix с SYBR Green I, 2х conc.,
  • праймеры,
  • ДНК.

Порядок действий при выполнении анализа:

  1. 1. Подготовка реакционного планшета.
    • Отметить на схеме реакционного планшета расположение лунок с образцами.
      В 1.5 мл пробирке на льду приготовить смесь для проведения ПЦР в соответствии с таблицей:

    • Нанести готовую смесь на реакционный планшет в выбранные для анализа лунки.
      Добавить по 5 мкл исследуемой ДНК или стандарта в соответствующие лунки.
      Закрыть лунки прозрачной пленкой.
      До установки в прибор реакционный планшет следует хранить на льду. 
  1. 2. Создать документа в программе ABI 7500 software.
    • Выбрать в колонке Set Up раздел Advanced Setup.
      В открывшейся вкладе ввести:
         в строке Experiment Name – имя эксперимента,
         прибор:  7500 Fast (96 Wells),
         тип анализа: Absolute Quantification (Standard Curve),
         используемые реагенты: SYBR Green 1,
         скорость анализа: Fast.
      Нажать клавишу "Next".
      В открывшейся вкладке ввести количество и названия проб и мишеней.
      Перейти в правую вкладку и определить положение проб, контролей и мишеней на планшете.
      Нажать клавишу "Next".
      В открывшейся вкладке ввести ввести:
      • объем реакционной смеси – 20 мкл,
      • количество циклов – 45,
    • Задать следующую программу для работы прибора:

    • После этого выбрать опцию File > Save As, ввести название документа, затем нажать на клавишу "Save".
      Установить планшет в прибор.
      Нажать на клавишу "Start run". После завершения цикла на экран выводится сообщение об успешно проведенном цикле или о допущенных ошибках.
  1. 3.Анализ данных.
    • Для анализа данных нажать на клавишу "Analyze".
      При необходимости отрегулировать вручную базовую линию и пороговое значение сигнала.
      Просмотреть результаты анализа.
      ВАЖНО! При анализе обратить внимание на параметры, помеченные желтыми флажками.