Описание прибора:

Прибор Applied Biosystems7500 Real Time PCR предназначен для количественного определения нуклеиновых кислот и качественного определения последовательностей нуклеиновых кислот. Указанные типы анализов обеспечиваются с помощью флуоресцентно меченых реагентов для проведения ПЦР и анализа полученных результатов в режиме реального времени с использованием конечных данных и кривой диссоциации.

Реактивы и материалы:

  • MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode
  • Master Mix с SYBR Green I, 2х conc.
  • Праймеры
  • ДНК

Порядок действий при выполнении анализа:

  1. 1. Подготовка реакционного планшета.
    • Отметить на схеме реакционного планшета расположение лунок с образцами.
      В 1.5 мл пробирке на льду приготовить смесь для проведения ПЦР в соответствии с таблицей:

      Нанести готовую смесь на реакционный планшет в выбранные для анализа лунки.
      Добавить по 5 мкл исследуемой ДНК или стандарта в соответствующие лунки.
      Закрыть лунки прозрачной пленкой.
      До установки в прибор реакционный планшет следует хранить на льду. 
  1. 2. Создать документа в программе ABI 7500 software.
    • Выбрать в колонке Set Up раздел Advanced Setup
      В открывшейся вкладе ввести:
      В строке Experiment Name – имя эксперимента
      Прибор:  7500 Fast (96 Wells).
      Тип анализа: Absolute Quantification (Standard Curve)
      Используемые реагенты: SYBR Green 1
      Скорость анализа: Fast
      Нажать клавишу Next.
      В открывшейся вкладке ввести количество и названия проб и мишеней.
      Перейти в правую вкладку и определить положение проб, контролей и мишеней на планшете.
      Нажать клавишу Next.
      В открывшейся вкладке ввести ввести объем реакционной смеси: 20 мкл, количество циклов: 45, а так же задать следующую программу для работы прибора:

      После этого выбрать опцию File > Save As (сохранить файл как), ввести название документа, затем нажать на клавишу Save (сохранить).
      Установить планшет в прибор.
      Нажать на клавишу Start run. После завершения цикла на экран выводится сообщение об успешно проведенном цикле или о допущенных ошибках.
  1. 3.Анализ данных.
    • Для анализа данных нажать на клавишу Analyze.
      При необходимости отрегулировать вручную базовую линию и пороговое значение сигнала.
      Просмотреть результаты анализа.
      ВАЖНО! При анализе обратить внимание на параметры, помеченные желтыми флажками.