Метаболомика изучает конечные и промежуточные продукты обмена веществ в клетке. Метаболомный анализ в настоящее время рассматриваться как одно из самых перспективных направлений развития молекулярных методов в области системной биологии.

Современная метаболомика далеко вышла за рамки рамки постгеномного анализа и оценки раннего фенотипического отклика. Биохимическое состояние системы, описываемое метаболитным профилем, вполне может выступать в роли альтернативного взгляда на биологический объект. Оценка устойчивости и динамики таких состояний может сопровождать практически любой биологический эксперимент, мониторинг или наблюдение. При этом полученные данные могут существенно помочь в понимании процессов, происходящих на молекулярном уровне и даже дать ключ к возможности реализации управления этими процессами. Залогом успеха применения подобного подхода является возможность одновременной качественной и количественной характеристики очень большого числа малых биомолекул в исследуемом образце (по некоторым оценкам среднее число компонентов метаболитной сети составляет более 5000 соединений). Метаболитный профайлинг может дать очень интересную информацию о состоянии и поведении сложных динамических систем, которыми, по сути, и являются биологические объекты. Для его успешной реализации необходима аналитическая техника высокого класса включая хроматоргафическое и масс-спектрометрическое оборудование, представленное в ресурсном центре.

Установленное оборудование для газовой хромато-масс-спектрометрии позволяет проводить анализ таких веществ, как:

- сахара и их производные

- аминокислоты

- другие органические кислоты

- гормоны растений (ауксин, салициловая кислота, этилен, абсцизовая кислота)

- воски (сложные эфиры высших жирных кислот и высшие высокомолекулярные спирты)

Устновленное оборудование для жидкостной хромато-масс-спектрометрии позволяет проводить анализ:

- белков

- пептидов ( пептидные гормоны, цитокины, тахикины)

- глюкозинолатов

- фенольных производных 

Анализ компонентного состава эфирных масел с помощью двумерной газовой хроматографии

GC-MS – метаболомный анализ асцитных жидкостей

Анализ метиловых эфиров жирных кислот

 

 

 

Анализ компонентного состава эфирных масел с помощью двумерной газовой хроматографии

Используемое оборудование РЦ:

Двумерный газовый хроматограф-масс-спектрометр LECO Pegasus 4D в режиме GC x GC-TOF;

Виалы для автосамплера, завинчивающиеся крышки, септы.

Описание метода:

 Метод позволяет более детально характеризовать смеси  летучих фитогенных соединений, полученных гидродистилляцией растительного сырья. Может также использоваться для исследования и контроля препаратов, используемых в ароматерапии и для исследования аллелопатических связей, реализуемых посредством летучих соединений.

Растворители: гексан или хлороформ.

Подготовка пробы заключается в растворении предоставленного для анализа образца в хлороформе или гексане в концентрации 1 мг./мл. В случае образования осадка он удаляется фильтрованием через бумажный фильтр.

При получении эфирного масла методом гидродистилляции возможно наличие в пробе остатков воды. В этом случае проба высушивается добавлением безводного сульфата натрия с последующим фильтрованием.

Условия проведения анализа:

Газ-носитель: гелий. Режим постоянства потока 1мл/мин.

Температура испарителя: 250 °С. Работа со сбросом газового потока 1:50.

Колонка: BPX-5 (Supelco) 30м. х 0.25мм. Пленка неподвижной фазы 0.25 мкм.

Линейное программирование температуры  от 70 до 270 °С со скоростью 4 °С/мин.

Вторичная колонка: BPX-50 (SGE) 1.5м. х 0.1 мм. Пленка неподвижной фазы 0.1 мкм.

Линейное программирование температуры  от 75 до 275 °С со скоростью 4 °С/мин.

Превышение температуры термомодулятора: 15 °С.

Цикл термомодуляции: 4 сек.

Длительность импульса нагрева: 1.3 сек.

Температура зоны сопряжения с детектором: 250 °С.

Масс-спектрометрический детектор с ионизацией электронным ударом и времяпролетным анализатором.

Стандартная энергия ионизации: 70eV.

Диапазон сканирования: 50-500 mZ.

Скорость сканирования: 100 спектров в сек.

Сбор и обработка данных в режиме автоматической деконволюции и идентификации соединений с использованием масс-спектрометрической библиотеки NIST10.

Квантирование методом нормализации и визуализация результатов и помощью штатного программного обеспечения ChromTOF®.

Источник:

Буданцев, А. Л., & Шаварда, А. Л. (2013). Анализ эфирного масла Dracocephalum oblongifolium (Lamiaceae) с использованием полной двумерной хроматографии. Растительные ресурсы, 49(1), 107–117.

 

GC-MS – метаболомный анализ асцитных жидкостей

Используемое оборудование РЦ:

Газовый хроматограф-масс-спектрометр LECO Pegasus 4D в режиме GC – TOF;

Вакуумный концентратор CentriVac Labconco;

Виалы для автосамплера, завинчивающиеся крышки, септы.

Описание метода:

Пример реализации нецелевого метаболомного анализа, основанного на использовании GC-MS хроматографии модифицированного метаболитного пула.  Метод может быть использован для метаболомных исследований любых биологических объектов в области малых молекул, способных образовывать производные достаточно летучие для газо-хроматографического анализа. (фенольные соединения, органические кислоты, спирты, амины, аминокислоты, моно- и дисахариды и их производные и т.п.).

Реактивы: Бис-триметилсилилацетамид (BSTFA) (Fluka), пиридин.

Стандартный раствор трикозана (Sigma) в пиридине в концентрации 1000 ppm (1 мг/мл).

Подготовка пробы:

Главное требование к объекту при подготовке пробы – полное отсутствие воды, белков, полисахаридов и других макромолекул. Поэтому для анализа требуется лиофилизированный образец, обработанный метанолом или ацетонитрилом для высаживания большей части макромолекул.

Супернатант (1 мл.) после обработки лиофилизированной биологической жидкости метанолом или ацетонитрилом помещается в стандартную виалу и растворитель удаляется в вакуумном концентраторе.

В виалу добавляется 20 – 100 мкл. внутреннего стандарта (1000 ppm трикозана в пиридине).

Объем добавленного стандарта диктуется предполагаемым уровнем содержания метаболитов в пробе.

Протокол получения триметилсилильных производных.

1 вариант.      В виалу с аналитом и стандартом добавляется 20 мкл. BSTFA. Виала плотно закрывается и помещается в термостат при 100 °С на 15 мин.

2 вариант.      Возможно использование программируемого автосамплера Gerstel, которым оснащен Pegasus 4D для организации автоматического процесса силилирования. В этом случае в автосамплер загружаются виалы с пробами и добавленным стандартом. Добавление реагента и термостатирование перед запуском в хроматограф осуществляется автоматически.

Условия проведения анализа:

Газ-носитель: гелий. Режим постоянства потока 1мл/мин.

Температура испарителя: 300 °С. Работа со сбросом газового потока 1:20.

Колонка: BPX-5 (Supelco) 30м. х 0.25мм. Пленка неподвижной фазы 0.25 мкм.

Линейное программирование температуры  от 70 до 320 °С со скоростью 6 °С/мин., 15 мин изотермы.

Вторичная колонка: BPX-50 (SGE) 1.5м. х 0.1 мм. Пленка неподвижной фазы 0.1 мкм.

Линейное программирование температуры  от 75 до 325 °С со скоростью 6 °С/мин.

Термомодулятор не используется

Температура зоны сопряжения с детектором: 250 °С.

Масс-спектрометрический детектор с ионизацией электронным ударом и времяпролетным анализатором.

Стандартная энергия ионизации: 70eV.

Диапазон сканирования: 50-1000 mZ.

Скорость сканирования: 2 спектра в сек.

Полученные хроматограммы конвертируются в формат AIA (netCDF) для возможности использования программного обеспечения AMDIS и UniChrom, облегчающего построение метаболомных матриц.

Квантирование метаболомного профиля проводится по полному ионному току методом внутреннего стандарта без учета коэффициентов чувствительности (semi-quant).

Источник:

Shender, V. O., Pavlyukov, M. S., Ziganshin, R. H., Arapidi, G. P., Kovalchuk, S. I., Anikanov, N. A., … Govorun, V. M. (2014). Proteome-metabolome profiling of ovarian cancer ascites reveals novel components involved in intercellular communication. Molecular & Cellular Proteomics : MCP, 13(12), 3558–3571. doi:10.1074/mcp.M114.041194

 

Анализ метиловых эфиров жирных кислот

Используемое оборудование РЦ:

Двумерный газовый хроматограф-масс-спектрометр LECO Pegasus 4D в режиме GC x GC-TOF;

Виалы для автосамплера, завинчивающиеся крышки, септы.

Описание метода:

Двумерная реализация FAME- анализа. Позволяет идентифицировать транс-изомеры жирных кислот и различать расположение двойных связей.

Одна из методик, специально разработанная специалистами компании LECO для использования двумерного хроматографа Pegasus 4D.

Использование GCxGC-TOFMS метода существенно расширяет возможности обычного газо-хроматографического анализа метиловых эфиров жирных кислот не только за счет повышения эффективности разделения аналитов, но и предоставляет дополнительные возможности для их идентификации. Локализация разделенных соединений на двумерной хроматограмме образует корреляционные паттерны для насыщенных жирных кислот по временной оси для главной хроматографической колонки (длина углеродной цепи, или летучесть) и для ненасыщенных по оси вторичной хроматографии (число и характер двойных связей, или полярность). Это позволяет обнаружить большее число изомеров в анализируемом объекте и делать заключения о структуре кислоты исходя из ее положения на двумерной хроматограмме при отсутствии референсной MS или RI информации или стандартного соединения.

Подготовка пробы:

Гидролиз пробы с целью высвобождения жирных кислот и получение метиловых эфиров в РЦ не предусмотрены.

Условия анализа:

GC параметры: LECO Pegasus 4D с термомодулятором и вторичным термостатом.

Инжекция: 1 мкл. Сброс 1:50б 250 °С.

Первичная колонка: DB-5MS 30 м. х 0.25 мм. х 0,25 мкм. (Agilent).

Вторичная колонка: BPX-50 2 м. х  0.1 мм. х 0.1 мкм. (SGE)

Газ-носитель: гелий, 1 мл/мин., Постоянный поток.

Температура первичного термостата: 40°С, 2 мин., 30°С/мин. до 160°С, 2°С до 300°С, 5 мин. изотерма.

Температура вторичного термостата: 45°С, 2 мин., 30°С/мин. до 165°С, 2°С до 305°С, 5 мин. изотерма.

Перегрев  термомодулятора: 30 °С.

Время модуляции: 5 сек.

Горячий импульс: 1 сек.

Transfer Line: 250 °С.

Время анализа: 83.5 мин.

MS параметры: LECO Pegasus 4D GCxGC-TOFMS

Ионизация: EI, 70 eV.

Температура источника: 220 °С.

Диапазон масс сканирования: 45 – 650.

Скорость сбора данных: 100 спектров/сек.

Обработка, квантирование и визуализация результатов с помощью программного обеспечения ChromTOF®.

Источник 

LECO Application Notes: http://www.leco.com/support/application-support-separation-sciences/app-notes-separation-science?view=category&id=144