Метод проточной цитометрии позволяет измерять физические и химические параметры отдельных клеток или частиц. Он основан на регистрации флуоресценции и светорассеяния от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в струе жидкости. Данный метод чаще всего применяется при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. На приборе можно также исследовать диссоциированные клетки любых тканей, бактериальные клетки, микропланктон, флуоресцентные микросферы с зондами.

Прибор может быть использован для:

1. анализа клеток и частиц. Позволяет:

  • • идентифицировать отдельные классы, подклассы, популяции, субпопуляции, измерять их поверхностные или внутриклеточные маркеры;
  • • оценивать функциональное состояние клеток (митохондриальный потенциал, внутриклеточный кальций, pH) с использованием специальных ратиометрических красителей (FDA, DiOC1, JC -1 и др.);  
  • • оценивать функциональное состояние клеток с помощью специфических антител к фосфорилированным и не-фосфорилированным формам изучаемых белков;
  • • проводить многопараметрический (многоцветный) анализ проб; 
  • • проводить анализ параметров клеточного цикла и содержания ДНК в живых и фиксированных клетках;
  • • изучать кинетические параметры клеточных процессов (повреждение клеточных мембран, ферментативная активность);
  • • исследовать механизмы и стадии апоптоза с использованием разнообразных маркеров и зондов;
  • • проводить изучение фагоцитоза, в том числе в нейтрофилах крови и макрофагах;
  • • исследовать чувствительность клеток к цитостатикам путем определения уровня экспрессии белков (P-gp и др.);
  • • проводить молекулярно-генетические исследования (изучение отдельных хромосом и экспрессии генов);
  • • исследовать проточное кариотипирование хромосом с использованием флуоресцентных зондов.

2. сортировки клеток и частиц. Способен сортировать до 4 фракций одновременно из одного образца с максимальной скоростью сортировки 70000 частиц в секунду.

Размещение: Василеостровская площадка.

Статус: эксплуатация в рабочем режиме.

bd-facs-aria-3.jpg

Основные технические характеристики

Лазеры

  • • Фиолетовый 405 нм (мощность 50 мВт).
  • • Синий 488 нм (мощность 20 мВт).
  • • Красный 633 нм (мощность 18 мВт).

Позволяют регистрировать 13 первичных параметров: 2 параметра светорассеяния (forward scatter, side scatter) и 11 параметров флуоресценции.

Фильтры и рекомендуемые флуорохромы

  • • Для лазера с длиной волны 405 нм: одновременная регистрация сигнала от трех флуорохромов:

545LP ----- 560/40 ----- BV605, Pacific Orange, Alexa Fluor 430 
502LP ----- 510/50 ----- BV510, V500, AmCyan 
                   450/40 ----- V450, BV421, Pacific Blue, DAPI, Alexa Fluor 405

  • • Для лазера с длиной волны 488 нм: одновременная регистрация сигнала от пяти флуорохромов:

735LP ----- 780/60 ----- PE-Cy7 
655LP ----- 695/40 ----- PerCP-Cy5-5, PerCP, PE-Cy5, 7-AAD 
610LP ----- 616/23 ----- PE-CF594, PE-Texas Red, PI 
556LP ----- 585/42 ----- PE 
502LP ----- 530/30 ----- Alexa Fluor488, FITC, CFSE 
                   488/10 ----- SSC

  • • Для лазера с длиной волны 633 нм: одновременная регистрация сигнала от трех флуорохромов:

735LP ----- 780/60 ----- APC-Cy7, APC-H7 
690LP ----- 730/45 ----- Alexa Fluor700 
                   660/20 ----- APC, Alexa Fluor 647

Сопла (nozzle) для сортировки

70 мкм, 85 мкм, 100 мкм, 130 мкм.

Сортировочные емкости

Возможность сортировки в пробирки объемами 5 мл, 15 мл, микропробирки, в 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, на стекла.

Температура

Анализ и сортировка образца при температуре: 4°C, 20°C, 37°C и 42°C.

Оптическая система

  • • Представлена тремя лазерами с пространственно разделенными лазерными лучами:

  • 1) с длиной волны 488 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 20 мВт.
  • 2) с длиной волны 633 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 18 мВт.
  • 3) с длиной волны 405 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 50 мВт.
  • • Фиксированная, не требует пользовательской юстировки.

  • • Позволяет регистрировать 13 первичных оптических параметров, включая 2 параметра светорассеяния и 11 параметров флуоресценции.

  • • Возможно дооснащение дополнительными фотоэлектронными умножителями, дихроическими зеркалами и фильтрами для увеличения числа регистрируемых параметров флуоресценции до 18 и более.

Детекторная система

Представлена:

  • • детекторным блоком Octagon с круговым расположением шести фотоэлектронных умножителей и гнездами для восьми пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации бокового светорассеяния и сигнала от пяти флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 488 нм.

Набор дихроических зеркал 502ФНЧ, 556ФНЧ, 610ФНЧ, 655ФНЧ, 735ФНЧ и фильтров 488/10, 530/30, 585/42, 616/23, 695/40, 780/60 для регистрации бокового светорассеяния и сигнала от пяти флуорохромов (FITC, PE, PE-TR, PepCP-Cy5.5, PE-Cy7 или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 488 нм;

  • • детекторным блоком Trigon с круговым расположением трех фотоэлектронных умножителей и гнездами для трех пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации сигнала от трех флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 633 нм.

Набор дихроических зеркал 690ФНЧ, 735ФНЧ и фильтров 660/20, 730/45, 780/60 для одновременной регистрации сигнала от трех флуорохромов (APC, AlexaFluor700, APC-Cy7 или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 633 нм;

  • • детекторным блоком с круговым расположением трех установленных фотоэлектронных умножителей и гнездами для трех пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации сигнала от флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 405 нм.

Дихроическое зеркало 545ФНЧ, 502ФНЧ и фильтры 450/40, 510/50, 560/40 для одновременной регистрации сигнала от трех флуорохромов (PacificBlue, PacificOrange, AmCyan или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 405 нм;

 • детектором для регистрации переднего светорассеяния – фотодиод с фильтром 488/10 нм.

Наименьшее регистрируемое количество флуоресцентного сигнала прибором – 85 эквивалентов FITC (флуоресцеин изотиоцианат), 30 эквивалентов PE (фикоэритрин).

Сбор и обработка сигналов при анализе и сортировке

  • • Цифровая система регистрации сигнала с разрешением 18 бит.

  • • Поддерживается регистрация значений высоты, ширины и площади пика для сигналов от единичных клеток для всех регистрируемых первичных параметров.

  • • Скорость сбора данных – до 70 000 событий в секунду при регистрации 8 первичных параметров.

  • • Сбор и анализ цитометрических данных в стандартах FCS 3.0 и FCS 2.0 (стандарты хранения данных, принятые в проточной флуорицитометрии).

Система сортировки

  • • Сортировка клеток и частиц методом разделения капель в потоке.

  • • Возможность сортировки в пробирки объемами 5 мл, 15 мл, микропробирки, в 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, на предметные стекла и другие емкости для сбора клеток поддерживается встроенным в прибор блоком ACDU.

  • • Поддерживается возможность сортировки до 4 фракций одновременно из одного образца.

  • • Скорость сортировки до 70 000 частиц в секунду (включительно) при регистрации 8 первичных параметров в предлагаемой конфигурации.

  • • Регулировка частоты привода образования капель с максимальным значением 100 000 Гц.

  • • Полупроводниковый красный лазер и встроенная CCD-камера для регистрации свечения калибровочных флуоресцентных частиц в основном и боковых потоках в процессе сортировки частиц при настройке параметра задержки капли.

  • • Автоматическая система Accudrop для настройки и верификации параметра задержки капли в режиме реального времени при сортировке калибровочных флуоресцентных частиц, исключающая необходимость контрольной сортировки калибровочных частиц или клеток на предметные стекла и подсчета частиц.

  • • Чистота сортировки в режиме чистого выделения клеток до 98% и более (до 99.9% в зависимости от условий эксперимента).

  • • Логика сортировки на основе предустановленных шаблонов чистоты и выхода сортировки с 32 градациями тонкой настройки масок сортировки.

  • • Автоматический мониторинг стабильности параметров сортировки и положения точки формирования капель в процессе работы при помощи функции SweetSpot (выполняется программным обеспечением прибора).

  • • Автоматическая корректировка параметров сортировки при изменении положения точки формирования капель, выполняемая без вмешательства оператора при помощи функции SweetSpot (выполняется программным обеспечением прибора).

  • • Полностью закрытая камера с регулируемым давлением для размещения пробирок с сортируемыми образцами объемами на 1.5 мл, 5 мл, 15 мл.

  • • Настраиваемая остановка сортировки при риске контаминации сортируемых фракций

  • • Система термостатирования сортируемого образца и собираемых фракций при работе с пробирками и планшетами: термостатирование сортируемого образца на установках температуры 4, 20, 37, и 42°C, термостатирование собираемых фракций в диапазоне до 50°C.

  • • Поддерживается возможность сортировки заданного числа клеток или частиц (от 1 частицы).

  • • Поддерживается возможность сортировки клеток разных субпопуляций в одну емкость для сбора фракций или в лунку планшета в соответствии с заданной оператором пропорцией.

Гидравлическая система

  • • Проточная система на основе проточной кюветы, не требующая пользовательской настройки.

  • • Поддерживается возможность автоклавирования емкостей для проточной жидкости при подготовке к стерильной сортировке.

  • • Автоматические протоколы для промывки прибора перед началом и в конце работы, для дезинфекции прибора перед стерильной сортировкой, для промывки проточной кюветы и порта подачи образца – поддерживаются программным обеспечением прибора.

  • • В комплект входят сменные сопла, обеспечивающие фиксированное, не требующее регулировки, положение потока на выходе из проточной кюветы.

  • • Сменные сопла для сортировки в комплекте, размеры: 70 мкм, 85 мкм, 100 мкм, 130 мкм.

Программное обеспечение FACSDIva

  • • Пакет инструментов для обработки цитометрических данных, включая инструменты гейтинга, квадрантов, регионов, расчет статистики входит в программное обеспечение FACSDiva.

  • • Поддерживается возможность проведения анализа данных на основе иерархических определений клеточных популяций без использования логических комбинаций гейтов.

  • • Поддерживается ведение базы данных по результатам и настройкам экспериментов с поиском по ключевым словам.

  • • Автоматическая функция определения положения популяции клеток на графике при сдвиге интенсивности флуоресцентного сигнала при исследовании серии проб выполняется программным обеспечением FACSDiva.

  • • Поддерживается отображение данных на графиках с логарифмическими осями диапазона 7 декад.

  • • Поддерживается функция программной компенсации взаимного влияния регистрируемых флуоресцентных сигналов.

  • • Поддерживается функция настройки произвольного масштаба графиков для отображения данных, вплоть до отображения данных по единичным регистрируемым каналам.

  • • Программное обеспечение для анализа клеточного цикла ModFIT.

  • • Программное обеспечение для мультиплексных технологий анализа FCAPArray.

Калибровка и настройка прибора

  1. Программное обеспечение FACSDiva содержит встроенный протокол для автоматической проверки характеристик прибора (интенсивность, коэффициент вариации, эффективность сигнала, уровень шума) по калибровочным частицам для каждого регистрируемого параметра.

  2. Имеются встроенные в программное обеспечение FACSDiva средства ведения файлов Леви-Дженнингс по данным проведенных калибровок для мониторинга стабильности прибора.

  3. Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматическую настройку детекторов и мониторинг настроек по калибровочным частицам для флуорохромов: Indo 1, DAPI, Hoechst, Pacific Blue™, AmCyan, Qdot® 655, Qdot® 700, FITC, PE, PE-Texas Red™, PerCP, PerCP-Cy™5.5, PECy™7, APC, Alexa Fluor® 700, APC-Cy7, APC-HL750, их эквивалентов и др.

  4. Программное обеспечение FACSDiva поддерживает возможность ручного подбора пользовательских настроек детекторов.

  5. Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматический расчет параметров цветовой компенсации для всех возможных сочетаний регистрируемых параметров с использованием различных калибровочных материалов:

  • – по контрольным клеткам, окрашенным флуоресцентными антителами,
  • – по контрольным частицам, окрашенным флуоресцентными антителами.
  • Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматический расчет интенсивности свечения флуоресцентных частиц в боковом и центральном потоке при калибровке параметра задержки капли.

Требования к образцам

Перед подготовкой эксперимента, планируемого проводить на проточном цитофлуориметре, необходимо:

1. согласовать параметры эксперимента со специалистом Татьяной Чудиновой (желательно провести согласование до закупки флуоресцентных красителей и подготовки образцов) и прислать ей подробное описание эксперимента (см. ниже);

2. записаться у специалиста на работу на приборе (свободные и занятые дни можно увидеть в календаре занятости прибора). 

1) Требования к нативному образцу

На проточном цитометре можно исследовать только диссоциированные биологические образцы (клетки или частицы). Все образцы должны быть профильтрованы. Можно исследовать: 

  • - диссоциированные клетки любых тканей или культур,
  • - бактериальные клетки,
  • - микропланктон,
  • - флуоресцентные микросферы с зондами.

2) Требования к меткам

При работе на проточном цитометре можно использовать только флуоресцентные красители. При планировании эксперимента с использованием многоцветного анализа тщательно подбирайте комбинации флуорохромов в соответствие с установленными на приборе лазерами (на FACSAriaIII на данный момент установлены три стандартных твердотельных лазера: фиолетовый 405 нм, синий 488 нм и красный 633 нм) и фильтрами (см. технические характеристики)! Перед началом эксперимента выбор флуорохромов должен быть согласован со специалистом.

Общие требования к флуорохромам, используемым для многоцветного анализа

  • - Флуорохромы должны быть биологически инертны.
  • - Интенсивность флюоресценции флуорохрома, связанного с клеткой / частицей, должна быть высокой.
  • - Спектральное перекрытие эмиссии флуорохромов и соответственно компенсация должны быть минимальны (см. таблицу).
  • - В случае иммуногистохимического окрашивания флуорохромы должны легко соединяться с первичными / вторичными антителами.
  • - Использование традиционных флуорохромов преимущественно перед использованием тандемных флуорохромов.
Для того, чтобы подобрать флюорохромы для многоцветного анализа, которые можно использовать на приборе FACSAriaIII (с учетом установленных в нем лазеров и фильтров), рекомендуем использовать BD Fluorescence Spectrum Viewer:

Также для подбора комбинаций флуорохромов для многоцветного анализа можно использовать спектральный гид: http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrumguide/.

Флуорохромы, рекомендуемые использовать на данном приборе: см. выше в Основных технических характеристиках

3) Комплект образцов для проведения эксперимента

- Неокрашенный образец: 300 000 - 500 000 событий (клеток) в 1 мл раствора (PBS, BD Cell Wash, др.)

- Образцы, покрашенный отдельно каждым флуоресцентным красителем (для тех флуорохромов, для которых нужна компенсация): 100 000 событий (клеток) в 0.5 мл раствора (для расчета компенсации). 

- Экспериментальный образец (покрашенный всеми флуоресцентными красителями): в зависимости от того, сколько событий нужно проанализировать. 

Данные значения указаны в среднем для неуникального образца. Если образец уникальный или хорошо известный (например, кровь человека) значения можно изменять. 

Оптимально предоставлять образцы в 1.5-2 мл эппендорфах или в 5 мл пробирках. 

4) Описание эксперимента: необходимо прислать специалисту подробное описание части эксперимента, которая будет выполняться на проточном цитометре, по электронной почте: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.. В описании нужно указать:

  • 1. все популяции клеток, присутствующие в нативном образце (желательно нарисовать график (SSC, FSC) популяций клеток в образце и выделить на нем интересующею вас популяцию, которую вы планируете анализировать). Либо вместо графика можно прислать перечень популяций клеток в образце с указанием размеров клеток и их относительной гранулированности (!);
  • Пример: 
  • 2. исследуемые параметры: какими флуоресцентными маркерами (желательно указать производителя) они помечены; 
  • 3. какие лазеры и фильтры используются для регистрации каждого параметра (техн. харатеристики см. выше);
  • 4. по каким параметрам Вы собираетесь анализировать (и сортировать) интересующие Вас субпопуляции. Написать четкую схему.